Методы разделения и очистки белков, страница 4

При этом ее растворимость практически независит от температуры в диапазоне от 0 до 30°С. Во-вторых,плотность насыщ енного раствора этой соли равна 1,235 г-см'3, аплотность белка в таком растворе - 1,29 г-см’3, что позволяетдовольнолегкоотделитьбелковыйосадокпутемцентрифугирования. В-третьих, сульфат аммония доступен вдостаточно чистом виде, а, в крайнем случае, его можно легкоперекристаллизовать. Такая перекристаллизация бывает необходимадля удаления ионов тяжелых металлов, к которым особенночувствительны ферменты.

Наконец, в-четвертых, сульфат аммониядостаточно дешев, и его растворение не сопровождаетсявыделением тепла.Количество сульфата аммония, которое нужно добавить дляполучения необходимой концентрации соли в 1 литре раствора,можно рассчитать по формуле (15):19где533-(М 2-М ,)Количество (г) = ------------------------ ,4,05-0,3-М 2Mi - исходная молярность раствораМ2 - требуемая молярность раствора(15)Формула (15) учитывает увеличение объема исходногораствора при добавлении соли. Так, хотя растворимость сульфатааммония составляет 533 г/л' при 20°С, для получения насыщенногораствора к 1 л нужно добавить 761 г соли.

Объем такого растворабудет равен 1,425 л, а его плотность составит 1761/1425=1,235 г-см‘3.Концентрацию сульфата аммония обычно выражают впроцентах насыщения. Тогда насыщенный раствор имеет 100%-ноенасыщение. Кроме того, концентрацию сульфата аммония частовыражают в степени насыщения, которая для насыщ енного раствораравна 1. Тогда количество сульфата аммония (в г), которое нужнодобавить к раствору при 20°С для получения заданной степенинасыщения, рассчитывают по формуле (16):где0,533-V-(Cr C,)(16)Количество (г) = ------------------------ ,1-0,3-С2V - объем исходного раствора с концентрациейсульфата аммония, равной степени насыщ ения С|С| - исходная степень насыщ ения раствора сульфатомаммонияС2 - требуемая степень насыщения раствора сульфатомаммонияФормулы (15) и (16) основаны на допущ ении, что концентрацияраствора сульфата аммония со 100%-ным насыщ ением равна 4,05 М.Количество сульфата аммония, необходимое для полученияраствора с нужной степенью насыщения, можно также определитьпо номограмме или из справочной таблицы.Из-за присутствия в растворе других солей на практикеистинная растворимость сульфата аммония при 20°С будетнесколько меньше, чем 533 г/л.Навеску соли необходимо перетереть в ступке и добавлять краствору медленно, при постоянном перемеш ивании, дожидаясьполного растворения предыдущей порции соли.

Если увеличениеобъема раствора не сильно сказывается на процедуре выделения20белка, для фракционирования лучш е использовать насыщенныйраствор сульфата аммония, который, как и сухую соль, добавляю тнебольшими порциями при постоянном перемешивании. Какправило, такой прием используется для белков, которые полностьюосаждаются уже при 50% -ном насыщ ении солью, так как при этомобъем раствора возрастает только в два раза.

Объем насыщ енногораствора сульфата аммония, который необходимо добавить кфракционируемому раствору, можно определить по формуле (17):гдеV0-(C2 - C ,)V = ---------------------- ,(17)1-С2V - необходимый объем насыщенного растворасульфата аммонияV0 - исходный объем белкового раствораС] - исходная степень насыщения белкового растворасульфатом аммонияСз - требуемая степень насыщения белкового раствораРастворы сульфата аммония имеют слабо кислые значения pH,поэтомукрайнежелательно,чтобыбелковыйраствор,подвергаемый высаливанию, содержал буфер, препятствующийизменению pH.

Одним из сущ ественных преимуществ работы снасыщенным раствором сульфата аммония является то, что можнопредварительно довести значение pH этого раствора до требуемойвеличины, тем самым упрощая дальнейш ий контроль за pHфракционируемого белкового раствора.После добавления последней порции сульфата аммониясуспензию перемеш ивают в течение 15-30 мин для того, чтобыобеспечить полное осаждение высоленных белков, после чегоосадокотделяю т центрифугированием.Обычно достаточноцентрифугирования с ускорением 10000 g в течение 10-15 мин,однако при высоких концентрациях соли время центрифугированиялучше увеличить до 30 мин.

После окончания центрифугированиянадосадочную жидкость сливают. Если выделяемый белокнаходитсявсупернатанте,измеряю тегообъемипосоответствующей формуле или таблице рассчитываю т количествосоли, необходимое для последующего фракционирования. В томслучае, если нужный белок при данном насыщении сульфатомаммониявыпалвосадок,этотосадокрастворяю твсоответствующем буфере. Следует отметить, что объем буфера недолжен превышать объема осадка более чем в 1-2 раза, так как этого21достаточно, чтобы концентрация соли оказалась значительно нижетой концентрации, при которой белок выпадает в осадок. Если втаких условиях осадок растворяется не полностью, то вероятнеевсегонерастворимаяфракцияпредставляетсобойденатурированныйбелок,которыйнужноудалитьцентрифугированием или фильтрованием.Посравнениюсбольш инствомдругихметодовфракционирования, высаливание сульфатом аммония имеет одноочень существенное преимущество: суспензия белка в растворесульфата аммония сохраняет стабильность в течение длительноговремени (см.

ниже).Высаливаниеуспешноприменяетсянетолькодляфракционирования, но и для концентрирования белков при условии,что белковый раствор не слиш ком разбавлен. Если егоконцентрация меньше 1 мг/мл, то высаливание может оказаться неэффективным,поэтомупредварительноследуетувеличитьконцентрациюбелкав растворе,например,спомощьюультрафильтрации (см.

ниже).7. Удаление солей и смена буфера.На определенной стадии очистки и фракционирования белковчасто бывает необходимо удалить из белкового раствора соли илисменить буфер. С этой целью чаще всего используют диализ илигель-фильтращпо.Диализ предполагает удаление из образца низкомолекулярныхвещ еств и одновременную замену низкомолекулярных компонентовобразцананизкомолекулярныекомпонентыраствора,используемого для диализа. Диализ может сопровождатьсяувеличением объема образца. Это обусловлено тем, что суммарнаяконцентрация солей и высокомолекулярных соединений (например,белков) внутри диализного меш ка всегда выше концентрациинизкомолекулярных компонентов в диализирующ ем растворе. Привыравниванииосмотическогодавлениячастьводыиздиализирующего раствора переходит внутрь мешка, что приводит кразведению диализата.Диализные трубки самых разных сечений имею т поры,которые не пропускаю т молекулы крупнее определенного размера(этот размер может составлять от 500 Д а до 100 кДа).

Дляхарактеристикидиализныхтрубокиспользуютвеличинумолекулярных масс веществ, способных проникать через порыдиализного мешка. Этот параметр обозначается как MW CO {отангл. MWC.0 - m olecular weight cut-off) и, как правило, составляет2210-20 кДа. Все низкомолекулярные вещества свободно проходятчерез стенки диализного мешка, в результате чего устанавливаетсяравновесие низкомолекулярных компонентов внутри и снаружи(рис. 5). Для более быстрого установления равновесия диализнеобходимо проводить при постоянном перемешивании. Воизбежание протеолиза лучше диализовать белки на холоду.

Враствор для диализа с той же целью, что и в экстрагирующ ийраствор(см.выше),добавляю тР-меркаптоэтанолилидитиотреитол, а также ингибиторы протеиназ.Рис. 5. Диализ белкового препарата (по [Кольман, Рем, 2000]).Диализ белкового образца обычно проводят против 10-50кратного объема раствора для диализа. Ж елательно1-2 разасменить диализный раствор. Это обеспечивает более полноеудаление низкомолекулярных соединений, чем диализ образцапротив большого объема одной порции раствора.

Новые диализныетрубки для удаления из них различных химических примесейжелательно предварительно прокипятить в течение 1 часа врастворе, содержащ ем 100 мМ бикарбонат натрия и 20 мМ ЭДТА.Далее их промывают дистиллированной водой, кипятят вдистиллированной воде и хранят либо в 0,005% растворе азиданатрия, либо в 10-20%-ном этаноле при +2-4°С. После диализадиализные трубки тщ ательно промываю т дистиллированной водой,кипятят в дистиллированной воде и хранят, как это было указановыше.Несмотря на очень широкое применение, связанное в первуюочередь с простотой метода, диализ имеет два существенных23недостатка: 1) необходимость замены раствора для диализа, часто внеудобное (вечернее, ночное) время; 2) относительная длительностьпроцедуры.