Методы разделения и очистки белков

Рекомендовано к опубликованию решением Ученого и Учебно­методического советов биологического факультета МГУ имени М. В.Ломоносова.УДК 577.151ББК 28.07М 54Рецензенты:Гривенникова В.Г., кандидат биологических наук, доцент кафедрыбиохимии биологического факультета Московского государственном!университета имени М.В. ЛомоносоваЕвстафьева О.Л., кандидат биологических наук, доцент кафедр мбиохимииГОУВПОМ осковскийгосударственныймеди костоматологическийуниверситетФедеральногоагентствапоздравоохранению и социальному развитиюПособие в первую очередь предназначено для студентов 3-го куренкафедр биофизики, биоинженерии, иммунологии и физиологии животных,выполняющих практические работы в рамках раздела «Современные методыбиохимии», и для студентов 4-го курса кафедры биохимии, работающих нрамках большого практикума по разделу «Препаративная энзимологня»Пособие также может быть полезно для студентовдругих кафедрбиологического факультета МГУ, осваивающих биохимические методыисследования.ISBN 978-5-91587-036-8ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩ ЕНИЙТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ1.

Выбор исходного материала.2. Хранение исходного материала.3. Разрушение клеток.4. Экстракция растворимых белков.5. Центрифугирование.6. Методы фракционирования белков.6.1. Тепловая обработка.6.2. Изоэлектрическое осаждение.6.3. О саждение белков органическимирастворителями.6.4.О саждение белков высокими концентрациямисолей.7. Удаление солей и смена буфера.8. Концентрирование белков.9. Х роматографические методы разделения белков.9.1. Общ ие принципы хроматографии.9.2. А дсорбционная хроматография.9.3. Распределительная хроматография.9.4. Г ель-хроматография.О пределение молекулярной массы белка.9.5. Аффинная хроматография.9.6. И онообменная хроматография.Сорбенты для ионообменнойхроматографии.Выбор ионообменника.П одготовка ионообменника к работе.Заполнение колонки.Регенерация ионообменника.9.7.

Высокоэффективная жидкостнаяхроматография (ВЭЖ Х) или жидкостнаяхроматография высокого давления (ЖХВД)(HPLC - High Perform ance LiquidChromatography).10. Кристаллизация белков.11. Критерии чистоты белкового препарата и егоидентификация.ВЫ ДЕЛЕНИЕ ЯИЧНОГО АЛЬБУМ ИНАЦель работы.2344455913131416172224272729303135363947484950515152545757Задачи работы.Некоторые сведения о белке.ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬЗанятие 1.1. П риготовление реактивов.2.

П одготовка сорбента к ионообменнойхроматографии.Занятие 2.Вы деление яичного альбумина из куриного яйца.Занятие 2а.Подготовка препарата белка к хроматографии.Занятие 3.П роведение ионообменной хроматографии.Занятие 4.Анализ фракций, полученных в результатеионообменной хроматографии.ОФ ОРМ ЛЕНИЕ ЗАДАЧИЛИТЕРАТУРА57575959606162646566СПИСОК СОКРАЩ ЕНИЙВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматографияГ АП - гидроксиапатитДСН - додецилсульфат натрияДТТ - дитиотреитолДЕАЕ - диэтиламиноэтилЖ ХВД (HPLC) - жидкостная хроматография высокого давления(high perform ance liquid chromatography)KM - карбоксиметилМ АЛДИ (M ALDI) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (matrix assisted laser desorption/ionization)МЭ - Р-меркаптоэтанолПААГ - полиакриламидный гельТРИС - 3-гидроксиметиламинометанФМ СФ (PM SF) - фенилметилсульфонилфторид(phenylm ethylsulfonyl fluoride)ЭДТА - этилендиаминтетраацетатPVDF - поливинилидендифторид (polyvinylidene difluoride)зДля изучения некоторых физико-химических свойств белка,его структуры и функций необходимо выделить его из смеси другихбелков и получить в гомогенном или высокоочищ енном виде.

Насегодняш ний день разработано множество методов, позволяющихполучать индивидуальные белки.К сожалению, время, отведенное на практические занятия побиохимии студентам 3-го курса в рамках Малого практикума, непозволяет им ознакомиться со всеми современными методами.П оэтому многие вопросы, касающиеся выделения белков, будутподробно рассмотрены лишь теоретически на семинарскихзанятиях. В качестве практической работы студентам предлагаетсявыделить и очистить альбуминиз яйца кур, а такжепроанализировать чистоту полученного препарата белка методомэлектрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствиидодецилсульфата натрия (ДСН).ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ1.

Выбор исходного материала.Выбор исходного материала определяется целями и задачамиэксперимента. Часто исследователю необходимо изучить свойствабелка из конкретной ткани или органа. Тогда выбирать исходныйматериал не приходится. Если же тот или иной белок (фермент)присутствует в различных тканях, и у экспериментатора естьвозможность выбора, то часто он руководствуется следующимикритериями: 1) выбирает орган или ткань, где количество этогобелка больше или 2) его источник более доступен.В настоящее время особое внимание уделяется получениюрекомбинантных белков из бактериального материала, когда вбактерию вносят плазмиду, несущую ген исследуемого белка.Экспрессия этого гена может быть многократно усилена. В этомслучае можно получить большое количество изучаемого белка,содержание которого значительно превосходит количество всехостальных белков, что сущ ественно ускоряет и облегчает егоочистку.

В ряде случаев основные подходы к выделениюгомогенного белка из бактерий аналогичны методам получениябелков из тканей.2. Хранение исходного материала.Большое значение в процессе получения очищ енного белка иособенно фермента играет способ хранения материала. Часто для4получения некоторых белков, в первую очередь ферментов,недопустимо замораживание-размораживание тканей, так как в этомслучае происходит уменьшение или полная потеря их активности.Если же замораживание все же возможно, следует помнитьследующее: 1) замораживание нужно проводить как можно быстрее,посколькуоносопровождаетсялокальным,существеннымизменением pH среды; 2) хранить замороженную ткань следует притемпературе ниже -25°С (по возможности при -70-80°С).Важна не только скорость замораживания, но и скоростьоттаивания материала: чем она выше, тем лучше (при условии, чтоне происходит локального перегрева).

Рекомендуется погружатьконтейнер с тканью в теплую воду (40-50°С) и периодически еговстряхивать. В этих условиях температура оттаявшего раствора небудет подниматься выше 10°С до тех пор, пока не растает весь лед.3. Разрушение клеток.М ногие белки и больш инство ферментов локализованывнутри клеток, поэтому для их получения необходимо разрушитьклетки.

Существует множество методов разрушения клеток. Нарядуслегкоразруш аемымиклетками(эритроциты,клеткипаренхиматозных органов, клетки культуры тканей), существуютклетки с прочнымистенками (мышцы, растительныеибактериальные клетки). Такие клетки подвергаю т предварительномуразрушению, например, пропуская мышечную ткань черезмясорубку.Обработанную таким образом ткань подвергают дальнейш емуизмельчению и одновременному разрушению клеток путемгомогенизации. Существует несколько типов гомогенизации (табл.1) и соответственно гомогенизаторов. Для разруш ения мягкихтканей (например, печени) используют ручные или механическиегомогенизаторы (рис. 1а), в которых плотно прилегающий к стенкамгомогенизатора пестик вращается и, осуществляя возвратно­поступательное движение, обеспечивает перетирание тканей. Дляболее жестких тканей (например, мышечных) применяют ножевыегомогенизаторы типа Уорринга, работающ ие по принципу ножевогомиксера (рис.

16), перетирают ткань с абразивным материалом илиразрушают ультразвуком (табл. 1).4. Экстракция растворимых белков.Как правило, разруш ение клеток проводят в той среде, вкоторую нужно экстрагировать растворимый белок. Часто вкачестве экстрагирующ егораствораиспользуютбуферный5Рис. 1. Основные типы гомогенизаторов: а - ручной илимеханический гомогенизатор Поттера, б - ножевой гомогенизаторУорринга [http://w w w.com parestoreprices.co.uk/im eges/w a/w aring-prosignature-blender.jpg],вножевойгомогенизатор[http://w w w/express-plus.ru/-im ages/1356.jpg], г - ультразвуковойдезинтегратор[http://w w w.hiebsher.com /im ages/up50h_at_stand_p0500.jpg].раствор с оптимальным значением pH, а для тканей, где интенсивнопротекает процесс гликолиза (например, мышцы),буферзаменяют слабым раствором щелочи. В некоторых случаях белкиможно экстрагировать водой.Чтобы избежать воздействия на белки и, особенно наферменты, ионов тяжелых металлов (которые могут присутствоватьв реактивах и инактивировать ферменты), а также другихдвухвалентных ионов, в экстрагирующий раствор добавляю т ЭДТА- этилендиаминтетраацетат(C O O C -H 2C)2- N - C H 2-C H 2- N -(C H 2-C O O ')2)комплексондвухвалентных ионов.