Ингибирование теломеразы человека, страница 6

21).Рис.21.Химическиемодификацииуглеводо-фосфатногоостоваолигонуклеотидов: a – природный динуклеотид с фосфодиэфирной связью, б –тиофосфатный динуклеотид, в – 2’-O-метилдинуклеотид, г – динуклеотид сN3'→P5'-фосфамидной связью, д - динуклеотид с N3'→P5'-тиофосфамиднойсвязью, е – ПНК.442’-O-Meтил и 2’-O-метоксиэтил (2’-MOE) содержащие олигонуклеотиды[117] образуют более стабильные дуплексы с комплементарными мишенями иингибируют теломеразу уже в наномолярных концентрациях [118]. 2’-MOEмодификации,кромезначительнойстабилизациидуплекса,такжеспособствуют улучшению фармакокинетики олигомера.Тиофосфатные олигонуклеотиды (рис. 21б) – самый распространенныйтип модифицированных олигонуклеотидов [119], также были использованы дляингибирования теломеразы.

Они имеют высокую нуклеазную стабильность, нопри попытке их использования для ингибирования теломеразы наблюдалосьнеспецифичное ингибирование. Например, тиофосфатный олигонуклеотид SODNS ингибирует теломеразу за счет связывания с белком hTERT, а не с РНКБолее[120].того,олигонуклеотидбылоингибируетпоказано,теломеразучто20-звенныйнезависимооттиофосфатныйнуклеотиднойпоследовательности [121]. Кроме того, из-за неспецифического связывания сбелками такие олигонуклеотиды являются иммуностимулирующими [122].Такимобразом,перспективнымпредставляетсяиспользованиедляингибирования теломеразы олигонуклеотидов с небольшим количествомтиофосфатных модификаций, что позволит сохранить специфичность приувеличении нуклеазной стабильности.В фосфамидных олигонуклеотидах атом кислорода в 3’-положенииуглеводногоостатказамененна атом азота(рис.21г) [65].Такиеолигонуклеотиды образуют более стабильный дуплекс с комплементарноймишенью по сравнению с природными ДНК и при этом сохраняютспецифичность.

Следует отметить, что дуплексы таких олигонуклеотидов сРНК не являются субстратами РНКазы Н. Тиофосфамидные олигонуклеотидыболее стабильны к действию нуклеаз, чем фосфамидные олигонуклеотиды, чтоприводит к заметному увеличению ингибирования теломеразы [123]. Наиболее45известныйингибиторэтогокласса–вышеупомянутыйконъюгаттиофосфамидного олигонуклеотида с пальмитиновой кислотой GRN163L илиImetelstat.Пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) построены на основе N-(2аминоэтил)-глицинового остова и не имеют отрицательного заряда (Рис. 21е).Пептидные нуклеотиды связываются с комплементарными нуклеиновымикислотами с высокой афинностью и специфичностью [124,125].

Как правило,для увеличения растворимости в водных растворов ПНК синтезируют в видеконъюгатов с пептидами. Еще одним подход для доставки in vitro основан наиспользовании дуплекса ПНК с комплементарным олигонуклеотидом, чтопозволяет использовать традиционные катионные липиды [126]. Далее вэндосомах олигонуклеотид в составе дуплекса расщепляеся нуклеазами, аосвобожденная ПНК может взаимодействовать с мишенью. Несмотря наотличные результаты in vitro, результаты in vivo не столь значительны, чтосвязанос высокойтоксичностью такихолигомеров.

Тем не менее,использование гетеродуплекса ПНК с конъюгатом олигонуклеотида сасиалофетуином позволило эффективно доставлять ПНК в гепатоциты мышампри внутривенном введении с помощью асиалогликопротеино-рецепторопосредованного эндоцитоза [127].Рассмотрим подробнее олигонуклеотидные ингибиторы теломеразы,классифицировав их на основе механизма действия.1.5.4.1. Применение олигонуклеотидов, взаимодействующих с мРНКhTERTВ большинстве случаев именно экспрессия каталитической субъединицыhTERT коррелирует с активностью теломеразы [17], а мРНК hTERT46используетсявкачествеантисмысловыхмаркераопухолевогоолигонуклеотидов,процесса.комплементарныхПрименениемРНКhTERT,инактивирует теломеразу, что препятствует пролиферации опухолевых клеток,а при достижении критической длины теломер в них индуцируется апоптоз.Былопоказано,чтоолигонуклеотид(Cantide),комплементарный3'-нетранслируемой области человеческой мРНК hTERT, специфично снижаетуровень активной теломеразы в культуре клеток HepG2 [128] в 5 раз посравнению с необработанными клетками, что способствовало индукцииапоптоза и приводило к гибели более чем половины клеток.

Кроме того, былапродемонстрирована противоопухолевая активность этого олигонуклеотида наксенотрансплантатах опухолей в иммунодефицитных мышах [129]. На моделяхксенотрансплантата гепатоцелюлярной карциномы у мышей и первичнойлимфомы печени иммунодефицитных мышей было показано, что рост и весопухоли снижается при увеличении концентрации олигонуклеотида Cantide чтоприводиткувеличениювыживаемостимышей[130].Рассмотренныеолигонуклеотиды ингибируют теломеразу по пути, отмеченному цифрой 3 нарис.

1.Второйпутьуменьшениятеломеразнойактивностиспомощьюантисмысловых олигонуклеотидов к мРНК hTERT – изменение направлениясплайсинга этой РНК (рис. 1, цифра 2). мРНК hTERT имеет несколько сплайсформ, при этом только с двух из них синтезируется белок, и только один изэтих белков функционально активен [131]. Второй белок не содержит вактивном центре фермента важные для синтеза теломерного повторааминокислоты(доминантно-негативнаямутантнаяформаhTERT).Приэкспрессии только доминантно-негативной мутантной формы hTERT клеткипогибают по причине укорочения теломер [131]. В процессе неопластическойтрансформации при возникновении опухоли шейки матки соотношение сплайс-47форм оставалось постоянным [132].

Несмотря на это, искусственноеперенаправлениеальтернативногосплайсингавсторонуувеличениянефункциональных сплайс-форм мРНК hTERT – это один из возможных путейснижения теломеразной активности в опухолевой клетке [133]. Недостаткомтакого метода является продолжительность процесса (иногда – месяцы), т.к.опухолевые клетки погибают лишь при достижении критической длинытеломер. В течение всего этого времени необходимо постоянно применятьтерапию. При полной потере hTERT клетки подвергаются апоптозу, минуяукорочение теломер. Это связано с тем, что hTERT участвует в другихклеточных процессах – активация Wnt, NF-κB путей, ингибирование апоптоза идругих [134].1.5.4.2.

Воздействие олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы наhTRОлигонуклеотиды,комплементарныетеломеразнойРНКhTR,ингибируют теломеразу несколькими способами: например, уменьшая времяжизни hTR в клетке [135], блокируя сборку теломеразы [136] или ингибируяполимеразную активность теломеразы in vitro [137]. Именно к последнему типуотносятся, рассмотренные выше в странице 29, антагонисты матричногоучастка теломеразной РНК.Уменьшение времени жизни hTR в клетке может быть достигнутодеградацией с помощью РНКазой L [137]. 5’-фосфорилированный 2’-5’олигоаденилат(2-5А),гидролизирующиикоторыйодноцепочечнуюактивируетРНК,вклеткеэффективноРНКзусL,высокойспецифичностью стимулирует деградацию комплементарной РНК, тем самымувеличивая эффективность ингибирования в 20 раз [135].481.5.4.3. Олигонуклеотидные ингибиторы, нарушающие сборкутеломеразыИнгибированиевзаимодействиясборкителомеразытеломеразнойОлигонуклеотиды,РНКкомплементарныеиоснованонаблокированиикаталитическойсубъединицы.участкамhTR,необходимымдлявзаимодействия с компонентами теломеразного комплекса, нарушают сборкутеломеразы.

В этом случае подавление теломеразной активности в клеткахдостигается за счет уменьшения количества корректно собранной активнойтеломеразы [136]. Нарушение сборки теломеразы может приводить не только кпотере теломеразной активности, но и к увеличению деградации теломеразнойРНК в клетке из-за ее доступности нуклеазам.

Кроме стерическогоблокирования участков hTR от взаимодействия с другими необходимыми дляфункционирования теломеразы компонентами комплекса, возможно нарушениесборки пространственной структуры РНК, важной для работы теломеразы,например, псеводоузла [139].Преимуществом подхода ингибирования теломеразного комплекса засчет сборки является сохранение экспрессии теломеразных компонентов вклетке, что позволяет сохранить альтернативные от поддержания длинытеломерфункциителомеразныхкомпонентов[140].Этопозволяетпредположить меньшее число побочных эффектов при использовании такогоподхода к ингибированию теломеразы.1.6. ЗаключениеИз литературного обзора можно сделать вывод о том, что разработкановых подходов к ингибированию теломеразы актуальна и перспективна длясоздания новых противоопухолевых препаратов. На данный момент нет ни49одного одобренного FDA препарата, влияющего на теломеразу.