Ингибирование теломеразы человека

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙУНИВЕРСИТЕТимени М. В. ЛОМОНОСОВА__________________________________________________________Химический факультетАжибек Дулат МейирбековичИнгибирование теломеразы человекадиссертация на соискание учёной степеникандидата химических наук02.00.10-биоорганическая химияНаучные руководители:к.х.н., доц. Зверева М.Э.член-корр.

РАН, проф. Донцова О.А.МОСКВА20152СОДЕРЖАНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ6ВВЕДЕНИЕ71 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ101.1 Введение в обзор литературы101.2 Иммунотерапия121.3 Генная терапия151.4 Ингибирование работы теломеразы161.4.1 Методы измерения теломеразной активности181.4.1.1 ТРАП анализ181.4.1.2 Устранение ингибирования ПЦР241.4.1.3 In vivo ТРАП251.4.2 Низкомолекулярные вещества и Иметелстат1.5 Ингибирование биогенеза теломеразы26321.5.1 Ингибирование транскрипции hTERT321.5.2 Ингибирование пострансляционной модификации hTERT351.5.3 Уменьшение доступности теломер для теломеразы361.5.4 Олигонуклеотиды для ингибирования теломеразы431.5.4.1 Применение олигонуклеотидов, взаимодействующих с мРНКhTERT451.5.4.2 Воздействие олигонуклеотидных ингибиторов теломеразы наhTR471.5.4.3 Олигонуклеотидные ингибиторы, нарушающие сборкутеломеразы4831.6 Заключение482 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ502.1 Разработка метода детекции теломеразной активности502.1.1 Очистка теломеразного экстракта502.1.2 Устранение ингибирования ПЦР562.1.3 Проверка метода на низкомолекулярных G4-квадруплекс лигандах 612.1.4 Ингибирование теломеразы новым металлорганическим соединением,содержащим медь632.1.5 Рекомбинантная экспрессия теломеразы и вальпроевая кислота662.2 Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы2.2.1 Дизайн химерных бифункциональных олигонуклеотидов71712.2.2 Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vitro 762.2.3 Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo 792.2.3.1 Проверка ингибирования ПЦР для in vivo ТРАП метода812.2.3.2 Стабильность химерных олигонуклеотидов в клеточых линиях изащита 5’-конца832.2.3.3 Длина и расположение линкера842.2.3.4 Специфичность химерных олигонуклеотидов852.2.3.5 Токсичность химерных олигонуклеотидов872.2.3.6 Уровень теломеразной РНК в системе in vivo в присутствийхимерных олигонуклеотидов872.2.3.7.

Сборка теломеразного комплекса в присутствии химерныхолигонуклеотидов в условиях in vivo892.3 Заключение933 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ9543.1 Реактивы и биопрепараты953.2 Получение S100 экстракта1003.3 Проверка деградации олигонуклеотида в S1001003.4 ТРАП с визуализацией в полиакриламидном геле («Классический» ТРАП)1003.5 Клонирование1013.5.1 Получение конструкций для рекомбинантной экспрессии теломеразы1013.5.2 ПЦР1023.5.3 Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле1033.5.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля1033.5.5 Приготовление векторов и вставок1043.5.6 Приготовление компетентных клеток E.

coli1053.5.7 Трансформация компетентных клеток E. coli1053.5.8 Выделение плазмидной ДНК для клонирования1063.6 Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в эукориотические клетки1063.7 Трансфекция плазмид в эукариотические клетки для анализа и обработкавальпроевой кислотой (ВПА)1083.8 Экспрессия и очистка теломеразы1093.9 Метод измерения ингибирования теломеразы in vitro (RQ-ТРАП)1103.10 Прямой метод измерения теломеразной активности1113.111 Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотида 15bpLC1123.12 Трансфекция клеток ингибиторными олигонуклеотидами и получениеклеточного экстракта1123.13 In vivo RQ-ТРАП11353.14 Проверка сборки теломеразы1133.15 Определение количества hTR с помощью метода обратнойтранскрипции сопряженной с ПЦР (RQ-ПЦР)1143.16 Получение hTR методом in vitro Т7-транскрипции1153.17 Определение уровни hTR в клетках с помощью RQ-ПЦР1153.18 МТТ анализ цитотоксичности олигонуклеотидов1164 ВЫВОДЫ1175 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................

1186 ПРИЛОЖЕНИЕ ................................................................................................ 133Приложение 1133Приложение 2137Приложение 31416Список сокращенийДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаДТТ – дитиотреитолмРНК – матричная РНКПЦР – полимеразная цепная реакцияРНК – рибонуклеиновая кислотаРНКаза – рибонуклеазаdNTP – смесь дезоксинуклеотидтрифосфатовTR – теломеразная РНК (Telomerase RNA)TERT – белок теломеразной обратной транскриптазы (Telomerase reversetranscriptase), hTERT – TERT человекаТРАП – протокол амплификации теломерных повторовFDA - (Food and Drug Administration - Министерства здравоохранения исоциальных служб США, занимающееся контролем качества пищевыхпродуктов, лекарственных препаратов)G4-лиганды – соединения, связывающиеся с G4-квадруплексамиЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоцитыВПА – вальпроевая кислотаПНК – пептидная нуклеиновая кислота7ВведениеЧисловновьдиагностируемыхонкологическихзаболеванийувеличивается с каждым годом.

Как причина смертности онкозаболеванияявляются первыми в экономически развитых и стоят на втором месте вразвивающихся странах [1]. Получение данных, позволяющих в дальнейшемразработать новые подходы для лечения таких заболеваний, несомненно,актуальная задача.Причиной онкологических заболеваний являются свои же клеткиорганизма, в которых происходит нарушение механизма контроля числаделений, что приводит к неограниченному росту клеток. Это делает сложнымдиагностику на ранних стадиях заболевания и последующую селективнуюборьбу с такими клетками. Перерождение соматических клеток в опухолевыедостаточно сложный и долгий процесс, который еще до конца не изучен длявсех известных типов клеток. До появления злокачественной опухоли всоставляющих ее клетках происходит появление многочисленных нарушенийгенома, приводящих к активации или подавлению функций генов.

Мутации,приводящие к перерождению, могут быть различны для каждого типа клеток,поэтому даже для одного органа может встречаться большое количество видови субтипов опухоли [2].Подавление работы генов, которые активированы в опухолях – этосовременный подход к терапии онкологических заболеваний, которыйназывается целевой или таргетной терапией. При целевой терапии обычноингибируется процесс или нейтрализуется белок (его мРНК) без которыхопухолевая клетка не сможет жить. Такие процессы и белки (мРНК)называются мишенями. Спектр возможных мишеней и разрабатываемых к нимнаправленных препаратов для терапии онкозаболеваний достаточно широкий.8Однако из-за гетерогенности опухоли в ней могут присутствовать опухолевыеклетки различных типов с разными мишенями, поэтому наибольший интереспредставляет исследование мишеней, встречающихся в различных типахопухолевых клеток.

Чем универсальнее мишень, тем больше типов опухолевыхклеток будет подвергаться терапии. К таким универсальным мишенямотносится теломераза, поддерживающая длину теломер [3].Концы хромосом млекопитающих не содержат генов и состоят изповторяющихся последовательностей TTAGGG, связанных с различнымиспецифическимибелками.ТакиеконцевыеДНК-белковыеструктурыназываются теломерами. ДНК компонент теломер состоит из повторяющихсядвухцепочечных участков и имеет 3'- выступающий G-богатый конец длиной50-400 н.о. [4].При каждом делении клетки длина теломер укорачивается. Механизмукорочения заключается в недорепликации ДНК. В прошлом веке сталоизвестно, что большинство соматических клеток делится ограниченноеколичество раз [5], так как в клетках присутствуют механизмы арестапродвижения по клеточному циклу, не допускающие критического укорочениятеломер.

При критическом укорочении структура теломер теряется, чтоприводит к апоптозу. Клетки, потерявшие механизмы ареста клеточного цикла,продолжают делиться до критического укорочения теломер [6]. При потеретеломерами своей структуры концы хромосом начинают объединяться путемслияния концов, что приводит к гибели клетки [7]. Некоторые из таких клетокмогут избежать гибели за счет активации теломеразы. Клетки, потерявшиемеханизмы ареста и избежавшие дальнейшей гибели, могут переродиться вопухолевые клетки.Теломераза человека – это рибонуклеопротеиновый комплекс, основнымикомпонентами которого являются теломеразная РНК (hTR), каталитическая9обратная транскриптаза (hTERT), а так же другие дополнительные белки [8].Теломераза обладает обратно-транскриптазной активностью и de novoсинтезирует теломерные повторы на концах существующих теломерНе все компоненты теломеразы, необходимые для ее функционирования вклетке, можно рассматривать как потенциальные мишени для ингибированиятеломеразы [9], только воздействие hTERT и hTR абсолютно необходимы длятеломеразной активности.

Остальные компоненты теломер участвует вбиогенезе теломеразы и не являются необходимым для активности теломеразы.Теломераза экспрессируется в 80-90% типов опухолевых клеток [10].Выключение работы теломеразы приводит к исчезновению одного изпризнаков опухолевой клетки – неограниченного деления [2]. Цельюлитературного обзора стало обобщение данных об использовании теломеразыкак мишени для разработки противоопухолевых препаратов. Диссертационнаяработа посвящена поиску новых ингибиторов теломеразы и подходов для ихсоздания.101. Обзор литературы1.1.АктивированиеВведение в обзор литературытеломеразыпрепятствуетукорочениюхромосомвпроцессе репликации и обеспечивает неограниченный потенциал деленияклеток [11].

Известно, что теломераза активна в эмбриональных, стволовых,половых и опухолевых клетках [12,13]. Теломераза является перспективноймишенью для противораковой терапии. Однако, использование ингибиторовтеломеразы может сопровождаться побочными эффектами, затрагивающими, впервую очередь, стволовые клетки, в которых теломераза активна инеобходимадляподдержаниярегенеративногопотенциалаижизнеспособности. Несмотря на это, различные подходы к ингибированиютеломеразы разрабатываются уже более десяти лет [14].Для блокирования работы теломеразы можно влиять на биосинтезкомпонентов комплекса, созревание, сборку или корректное взаимодействиемежду компонентами теломеразы, на взаимодействие комплекса в целом ссубстратом. На рис. 1 представлены основные этапы, на которых можнозаблокировать функционирование теломеразы, и мишени для их воздействия.Такими основными мишенями являются процессы, связанные с транскрипциейгена hTERT (рис.