Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 14

Готовилираствор гибридного белка (0,01 мг/мл) в охлажденном 50 мМ трис-ацетатом буферном растворе(pH 7,8), содержащем 20 мМ MgSO4, 2 мМ ЭДТА, 0,2 мг/мл BSA. По 50 мкл приготовленногораствора фермента вносили в 8-12 тонкостенных 0,5 мл микропробирок и инкубировали вводном термостате при температуре 47˚С. Через определенные промежутки времени отбиралиодну пробирку, инкубировали в снегу не менее 15 мин и определяли активность ферментапутем добавления 10 мкл пробы к 90 мкл предварительно разбавленной в 1,8 раз буфером PBSTсубстратной смеси ATP-LH2 с последующей регистрацией биолюминесцентного сигнала наприборе Spectramax M5 («Molecular devices», США).Определение степени биотинилирования гибридного белка Luc-bccp.

Использовалисорока кратный по отношению к концентрации гибридного белка избыток магнитных частиц,модифицированных стрептавидином в буфере PBS. В пробирку типа эппендорф с частицами(0,1 мг) помещали раствор Luc-bccp (100 мкл), предварительно разбавленный в 105 раз в буфереPBS до концентрации 6,02×10-5 мг/мл, удобной для измерения. Для предотвращения сорбциифермента на стенках пробирки добавляли раствор BSA до концентрации 0,1 мг/мл иинкубировали 40 минут при интенсивном перемешивании на орбитальном шейкере. Послеинкубации измеряли активность раствора Luc-bccp контрольного образца (без частиц) исупернатантапосленеспецифическогоотделениясвязываниямагнитныхпараллельночастицмагнитом.проводилиДляаналогичныйопределенияэкспериментсиспользованием люциферазы без биотинсвязывающего домена.Изучение олигомерного состава гибридных белков стрептавидин-люцифераза.Олигомерный состав гибридных белков определяли с использованием колонки SUPEROSE 1210/300 GL на хроматографической системе ÄKTApurifier 10.

100 мкл раствора фермента вбуферном растворе, HB3 наносили на колонку, уравновешенную буферным раствором,59содержащим 50 мМ Трис-ацетат, 100 мМ Na2SO4, pH 7,8, и элюировали тем же раствором соскоростью 0,3 мл/мин. Отбирали фракции объемом 0,5 мл. Затем 10 мкл разбавленной фракциигибридного белка в буферном растворе для элюции вносили в микрокювету, добавляли 90 мклсубстратной смеси ATP-LH2, предварительно разбавленной в 1,8 раз буфером PBS,перемешивали и регистрировали биолюминесцентный сигнал на люминометре ЛЮМ-1.Способность гибридных белков связывать биотин.

Биотинилированный BSAполучали с использованием реагента для биотинилирования фирмы Силекс согласноинструкции производителя, разбавляли до концентрации 5 мкг/мл в буфере NCA. Параллельноготовили раствор небиотинилированного BSA в такой же концентрации и в том же растворе. По100 мкл полученных растворов BSA вносили в лунки планшета для ИФА и инкубировали втечение ночи при 4 °С при постоянном перемешивании. Затем планшет 3 раза промывалипорциями по 200 мкл буферного раствора PBSТ, свободную поверхность блокировали PBSBSA в течение 2 часов при 37 °С и перемешивании (250 об/мин), затем три раза промывалипорциями по 200 мкл буферного раствора PBSТ. В лунки подготовленного планшета вносилипо 100 мкл раствора гибридного белка в PBST, инкубировали 1 час при 37°С и перемешивании(250 об/мин), затем 4 раза промывали порциями по 200 мкл PBST.

Затем в лунки вносили по100 мкл субстратной смеси ATP-LH2, предварительно разбавленной в 2 раза буфером PBST иизмеряли биолюминесцентный сигнал. Для определения исходной активности гибридногобелка к 20 мкл его раствора добавляли 80 мкл субстратной смеси ATP-LH2 предварительноразбавленной в 1,6 раз буфером PBST, перемешивали и измеряли биолюминесцентный сигнал.3.4.5. Применение гибридных белков Luc-bccp и Luc-SA виммуноферментном анализе для детекции клеток SalmonellaОпределение предела обнаружения люциферазы и гибридных белков на ее основе.Готовили серию растворов гибридных белков и люциферазы с различными концентрациями вбуферном растворе PBS, активность фермента измеряли путем добавления 100 мкл субстратнойсмеси ATP-LH2 к 100 мкл раствора белка с последующей регистрацией биолюминесцентногосигнала на приборе ЛЮМ-1.Получение комплекса гибридного белка Luc-bccp---SA. Готовили раствор, содержащий10-8 М стрептавидина и 10-8 М гибридного белка в 1%-ном буфере PBSТ-BSA, инкубировали втечение 30 минут (37 °С, 250 об/мин), разбавляли в необходимое количество раз и использовалив дальнейших экспериментах.Детекция клеток Salmonella иммунобиолюминесцентным методом.

По 200 мклраствора моноклональных мышиных антител против липополисахаридных антигенов клетокSalmonella (5 мкг/мл в буфере NCA) вносили в лунки стрипованного планшета, инкубировали 260часа при 37°С и перемешивании (250 об/мин), затем 4 раза промывали порциями по 200 мклPBST, блокировали свободную поверхность буфером PBS-BSA в течение 2 часов при 37°С,промывали 3 раза порциями по 200 мкл PBST и использовали для детекции клеток.Готовили серию последовательных разведений исходной суспензии клеток (10 8 КОЕ/млв PBS) буфером PBS с концентрациями клеток от 10 7 до 103 КОЕ/мл. По 100 мкл полученныхрастворов вносили в лунки планшета с сорбированными на его поверхности антителами иинкубировали в течение 2 ч при 37°С и перемешивании (250 об/мин).

Планшеты симмобилизованными клетками 3 раза промывали 200 мкл PBST. Затем в лунки симмобилизованными клетками вносили по 100 мкл раствора биотинилированных антител (5мкг/мл в PBSТ), инкубировали 1,5 ч при 37°С и перемешивании (250 об/мин). Несвязавшиесяантитела удаляли четырехкратным промыванием порциями по 200 мкл буфера PBST.

Послеудаления остатков буфера в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора комплекса Luc-bccp--SA , либо гибридного белка Luc-SA с концентрацией 10-8 M, инкубировали 1 ч при 37°С, приперемешивании (250 об/мин). Несвязавшиеся компоненты реакционной смеси удалялипятикратным промыванием планшета по 200 мкл PBST. После удаления остатков буфера влунки вносили по 50 мкл буфера PBS и 50 мкл субстратной смеси ATP-LH2и измерялиинтенсивность биолюминесценции в отдельных лунках стрипа на люминометре FB 12Femtomaster.Адсорбция плюроника на полистирольных частицах.

10 мг активированногоплюроника F-108-PDS, содержащего пиридилдисульфидные группы, растворяли в 800 мклдеионизованной воды. К полученному раствору аккуратно приливали 200 мкл суспензииполистирольных частиц, диаметром 240 нм и инкубировали в течение ночи при комнатнойтемпературе. После этого частицы были отделены от избытка плюроника центрифугированием(12000 g, 20 мин). Супернатант отбрасывали, частицы ресуспендировали в PBS. Процедурупромывания повторяли 3 раза.Химическая иммобилизация моноклональных антител с введенными SH-группамина полистирольные частицы, активированные плюроником.

Для введения поверхностныхтиоловых групп в антитела использовали реагент Траута (2-иминотиолан), реакция которогопротекает по доступным аминогруппам. К 250 мкл антител (4 мг/мл) в буфере B2, прибавляли20-кратный избыток 2-иминотиолана (свежеприготовленный раствор в том же буфере) иинкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Избыток реагента отделяли наколонке PD SpinTrap G-25, уравновешенной буфером B2. Полученные тиолированныемоноклональные антитела сразу же добавляли к суспензии полистирольных микрочастиц (500мкл, ≈ 1,3·1012 частиц), покрытых плюроником F-108, содержащим пиридилдисульфидныегруппы и инкубировали 2 часа при комнатной температуре.

Частицы с иммобилизованными61антителами отделяли от избытка антител центрифугированием (12000 g, 20 мин). Супернатантотделяли и спектрофотометрически определяли концентрацию непрореагировавших антител.Осажденные частицы ресуспендировали в буфере B2. Процедуру промывания повторяли 3 раза.БиолюминесцентныйиммуноферментныйанализклетокSalmonellaсиспользованием полистирольных микрочастиц с иммобилизованными антителами. К 30мкл полистирольных частиц с иммобилизованными антителами, полученных по методике,описанной выше (≈ 7·1010 частиц, PBS) добавляли 50 мкл инактивированных клеток Salmonellaв буфере PBS (106 – 103 клеток/мл), инкубировали 1 час при комнатной температуре приперемешивании, и промывали, как описано выше.

Затем частицы ресуспендировали в 100 мкл(50 мкг/мл) биотинилированных антител в буфере PBST, инкубировали 1 час при 37°С приперемешивании,промывали3разакак описаноранее.Послересуспендировали в 100 мкл раствора гибридного белка Luc-SAпромывкичастицы(40 нМ) в буфере PBS,инкубировали 30 минут при 37°С при перемешивании, промывали 3 раза как описано ранее.Затем, частицы ресуспендировали в 50 мкл PBS и переносили суспензию в ячейкустрипованного планшета, добавляли субстратную смесь ATP-LH2(50 мкл) и измерялиинтенсивность биолюминесценции.При получении всех калибровочных кривых измерения аналитического сигнала длякаждой точки проводили не менее трех раз, на основании которых рассчитывали среднеезначение и погрешность измерения.Предел обнаружения (Cmin) клеток в исследуемых образцах рассчитывали по формуламср1= ∑ =110 = √∑( − ср )2−1=1 =30,где xi – сигнал фона, s0 – стандартное отклонение фонового сигнала, S – коэффициентчувствительности, который определяется как производнаяконцентрацииопределяемогоаналитическогосигналаоткомпонента.

Измерения аналитического сигнала проводилиминимум 8 раз.623.4.6. Применение гибридного белка Luc-SA для детекциибиотинилированной ДНК клеток E. coliВыделение бактериальной ДНК методом температурного лизиса клеток в ТЕбуфере. Отбирали 1 мл среды, содержащей ночную культуру микроорганизмов.