Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА»ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиСМИРНОВА ДАРЬЯ ВАСИЛЬЕВНАГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ И КОНЪЮГАТЫ НА ОСНОВЕ ЛЮЦИФЕРАЗЫСВЕТЛЯКОВ LUCIOLA MINGRELICA И ИХ БИОАНАЛИТИЧЕСКОЕПРИМЕНЕНИЕСпециальности:03.01.04 – биохимия03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнология)Диссертацияна соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:доктор химических наук,профессор Н.Н.

УгароваМосква – 2015ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................................ 51.ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................... 72.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................................... 112.1. Люциферин-люциферазная система светляков и ее биоаналитических применение .. 112.1.1. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на детекции ее субстратов(АТP и люциферин) .................................................................................................................

142.1.2. Применение люциферазы в методах анализа, основанных на ее детекции как маркера.................................................................................................................................................. 152.2. Методы получения бифункциональных молекул на основе люциферазы ифотопротеинов ............................................................................................................................... 182.2.1.

Методы химической конъюгации. Основные подходы ................................................ 192.2.2. Химически полученные конъюгаты на основе люцифераз и фотопротеинов ............. 212.2.3. Методы генетической инженерии по созданию гибридных белков на основелюциферазы ............................................................................................................................. 252.2.4. Гибридные белки, полученные на основе люцифераз светляков................................. 262.3. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков вбиоспецифическом анализе ..........................................................................................................

322.3.1. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазы светляков вгетерогенном ИФА .................................................................................................................. 332.3.2. Применение гибридных белков на основе люциферазы светляков для определенияДНК или РНК ........................................................................................................................... 362.4. Биоаналитические системы на основе биолюминесцентного резонансного переносаэнергии (BRET) с использованием люциферазы. .....................................................................

392.4.1. Основные принципы BRET ........................................................................................... 392.4.2. BRET-системы на основе Renilla люциферазы ............................................................. 412.4.3. BRET-системы на основе люциферазы светляков ........................................................ 422.4.4. Аналитическое применение BRET на основе люциферазы ......................................... 463.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ....................................................................................

503.1. Вещества и реагенты .............................................................................................................. 5023.2. Штаммы и плазмиды ............................................................................................................. 533.3. Аппаратура ..............................................................................................................................

533.4. Методики проведения экспериментов ................................................................................. 543.4.1.Методы работы с ДНК ............................................................................................... 543.4.2.Конструирование плазмид ......................................................................................... 553.4.3.Получение гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA и термостабильной люциферазы L.mingrelica, содержащих His6-последовательность .................................................................

573.4.4.Изучение свойств гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA........................................... 583.4.5.Применение гибридных белков Luc-bccp и Luc-SA в иммуноферментном анализедля детекции клеток Salmonella .............................................................................................. 603.4.6.Применение гибридного белка Luc-SA для детекции биотинилированной ДНКклеток E. coli ............................................................................................................................ 633.4.7.Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансногопереноса энергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica ....

653.4.8.Гетерогенный конкурентный иммуноанализ прогестерона с использованиембиолюминесцентного метода детекции .................................................................................. 704.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................................... 724.1. Получение и свойства гибридного белка люциферазы с биотинсвязывающим доменом(bccp)................................................................................................................................................

724.1.1. Конструирование плазмиды .......................................................................................... 724.1.2. Свойства гибридного белка люцифераза-bccp .............................................................. 734.2. Получениеисвойствагибридныхбелковлюциферазысострептавидином..........................................................................................................................................................

764.2.1. Конструирование плазмид ............................................................................................. 764.2.2. Получение гибридных белков люцифераза-стрептавидин ........................................... 774.2.3. Свойства гибридных белков люцифераза-стрептавидин ............................................. 784.3.Применение гибридных белков Luc-SA и Luc-bccp в биоспецифическом анализе.......................................................................................................................................................... 814.3.1.

Специфическая детекция клеток Salmonella с использованием гибридных белков Lucbccp и Luc-SA............................................................................................................................ 8234.3.2. Гибридизационный анализ ДНК с использованием гибридного белка Luc-SA................................................................................................................................................... 854.4. Иммуноанализ прогестерона на основе биолюминесцентного резонансного переносаэнергии (BRET) с использованием люциферазы светляков Luciola mingrelica ....................

964.4.1.Конструирование системы для эффективного BRET ............................................... 964.4.2.Получение и свойства конъюгатов люцифераза-прогестерон................................ 1004.4.3.Получение и свойства конъюгатов антитело-краситель......................................... 1064.4.4.Оптимизация условий регистрации BRET-сигнала и анализа прогестерона ........ 1114.4.5.Гетерогенный иммуноанализ прогестерона с использованием биолюминесцентногометода детекции .....................................................................................................................

1225.ВЫВОДЫ ............................................................................................................................... 1276.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................... 1294СПИСОК СОКРАЩЕНИЙГА–глутаровый альдегидДНК–дезоксирибонуклеиновая кислотаДМФА–диметилформамидДТТ–1,4-дитиотреитолДЦК–дициклогексилкарбодиимидИФА–иммуноферментный анализКОЕ–колониеобразующая единицаПААГ–полиакриламидный гельПЦР–полимеразная цепная реакцияРНК–рибонуклеиновая кислотаТрис–трис(гидроксиметил)аминометанТМБ–тетраметилбензидинЭДТА–этилендиаминтетрауксусная кислотаA, A600–поглощение, поглощение при 600 нмAb–антителаAMP–аденозин-5’-монофосфатATP–аденозин-5’-трифосфатb–биотинBSA–бычий сывороточный альбуминbccp–биотин-связывающий доменHis6–гексагистидиновая последовательностьImax–максимальная интенсивность сигнала биолюминесценции илифлуоресценцииI–интенсивность сигнала биолюминесценцииFl–краситель Alexa-fluorFl-Ab–конъюгат антитело-красительkcat–каталитическая константаKm–константа Михаэлиса–константа Михаэлиса по ATPKmATP5KmLH2–константа Михаэлиса по люциферинуLH2–люциферинLuc–люциферазаGLuc–зеленая форма люциферазыRLuc–красная форма люциферазыLuc-Pg–конъюгат люциферазы с прогестерономLuc-SA–гибридный белок люциферазы со стрептавидиномLuc-bccp–гибридный белок люциферазы с биотин-связывающимдоменоммолекулярный весMWNHS–N-гидроксисукцинимидный эфирPDS–пиридил-дисульфидная группаPg–прогестеронPPi–неорганический пирофосфатPS–полистиролPVP–поливинилпирролидонRLU–относительные световые единицы, 1 RLU = 109квант/сSA–стрептавидинSDS–додецилсульфат натрияSPDP–N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионатTS–термостабильный мутант люциферазыλmax; λmax em–длина волны, при которой наблюдается максимум спектрабиолюминесценции (флуоресценции)λex–длина волны, при которой наблюдается максимумвозбуждения красителяATP-LH2–субстратная смесь для измерения люциферазной активности61.

ВВЕДЕНИЕАктуальность работы. В настоящее время актуальной задачей является создание новыхбиоаналитических высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов для определениянаноколичеств различных физиологически активных веществ и патогенных микроорганизмов.Одним из способов получения таких реагентов является создание бифункциональных молекуллибо генноинженерными методами, либо методами химической конъюгации. Такие молекулысовмещают в себе высокую чувствительность белка-детектора с высокой селективностьюкомпонента, способного связываться с изучаемой мишенью. Использование люциферазысветляковвкачествечувствительностьюбелка-детекторарегистрацииметкиобладаетрядомвследствиепреимуществ:высокогоквантовоговысокойвыходабиолюминесцентной реакции (окисление люциферина кислородом воздуха в присутствии ATPи Mg2+), низким фоновым сигналом, который определяется стабильностью субстрата иотсутствием люциферазы в анализируемых биологических системах, а также простойпроцедурой наработки и выделения белка в необходимых количествах.

Приоритетнымнаправлением получения бифункциональных молекул на основе люциферазы светляковявляется экспрессия генноинженерных конструкций. Среди гибридных белков на основелюциферазы наибольший интерес представляют биотин- и стрептавидин-люциферазы,позволяющиефиксироватьвысокоаффинныхмолекулулюциферазыбиотин-стрептавидиновыхнаповерхностивзаимодействий.Вмишенилитературепутемописаныбиотинилированные гибридные белки на основе люцифераз светляков P.