Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 9

Таблица 5Альтернативными методами детекции ДНК с использованием люциферазы являютсяполиферментные системы и гибридизационный анализ с использованием гена люциферазы. Вкачестве примера можно привести методику детекции ДНК ВИЧ с использованием конъюгатастрептавидин-пируваткиназа, синтезирующего ATP, который детектируется с использованием37люциферазы светляков [146]. Методика включала в себя ПЦР специфического участка,гибридизацию с зондом, иммобилизованным на поверхности и биотинилированными зондами,используемыми для детекции, иммобилизацию конъюгата стрептавидин-пируваткиназа набиотинилированныхзондахибиолюминесцентнуюдетекциюATP-продукта.Пределобнаружения был в два раза ниже, чем для методов с использованием гибридного белкалюцифераза-«цинковые пальцы»: 5 копий плазмиды, что эквивалентно 7*10-18 моль/лунка [146].Такой же предел обнаружения характерен и для гибридизационного анализа [50, 51].

Однакоизмерение люминесценции занимало довольно долгий промежуток времени: 60 мин в первомслучае, и 90 минут во втором [50].Гибридные белки на основе люциферазы могут быть использованы не только длядетекции патогенной или вирусной ДНК, но и для анализа ее модификаций: метилирования идр. Например, идентификация модификации гистонов и определение уровня метилированияпромоторных регионов генов-супрессоров опухолей используются при поиске биомаркеров, ипозволяет проводить диагностику на ранних стадиях развития опухолей.

Для этого впредставленную выше схему анализа могут быть добавлены дополнительные стадии отделенияцелевой (модифицированной) ДНК иммуномагнитным или иммуноосаждением с последующимее высвобождением (плавлением) из иммунокомплекса перед стадией ПЦР. В качестве примераможно привести определение уровня метилирования андрогенного рецептора [59]. В работе[59] на первой стадии проводили осаждение метилированной ДНК путем иммобилизации намагнитных частицах, содержащих на своей поверхности CpG-связывающие домены (MBD),специфичные к метилированной ДНК.

Несвязавшуюся ДНК удаляли. Иммобилизованную начастицах ДНК отделяли от частиц и проводили 27 циклов ПЦР, при которых помимоамплификации вводили биотин. Затем биотинилированную ДНК иммобилизовали на частицахпокрытых стрептавидином и детектировали с использованием гибридного белка GST-Zif268–Luc. Суммарную концентрацию ДНК (метилированной и неметилированной), принимаемую за100% определяли по аналогичной схеме, но без стадии иммуномагнитного осаждения.Аналитические характеристики системы представлены в Таблице 8. Данный метод позволяетполучить результат уже через 3,5 часа, в то время как традиционный метод: секвенированиедисульфитомнатриязанимаетоколо12часов,посколькутребуетпревращениянеметилированных цитозиновых остатков в урацил.

В альтернативном методе определенияметилирования ДНК [46] используются рестриктазы, расщепляющие только неметилированнуюДНК, однако данный метод не может быть использован для всех регионов генома вследствиеограниченного числа сайтов узнавания рестриктаз [147].Аналогичный подход был использован для детекции модификации гистонов [90]. Вработе [90] авторы предложили использовать гомогенный метод детекции ПЦР-продуктов38(вместогетерогенногосиспользованиеммагнитныхчастиц)сиспользованиембиолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET), который возникал присвязывании люциферазы с целевой ДНК, меченой интеркалирующим красителем BOBO-3.Стоит отметить, что данный метод существенно увеличивает специфичность анализа посравнению с методом, предложенным ранее на основе сочетания иммунопреципитации сколичественным ПЦР и детекцией ПЦР-продукта с использованием красителя SYBR Green,который не позволял различать специфический и неспецифический ПЦР-продукт.

Дляповышения специфичности широко используют метод ПЦР в режиме реального времени сиспользованием taqMan-проб [148], однако примеси, присутствующие в реальных образцах, внекоторых случаях могут оказывать влияние на активность ДНК-полимераз и, как следствие, нарезультаты анализа и выбор аналитической системы [149].Таблица 8. Системы для анализа модификации ДНКЛюциферазаАналитСпецифическийреагент дляотделения ДНКGST-Zif268Lucмодификациягистоновандрогенногорецептора,Специфическиеантитела кмодификациигистоновGST-Zif268LucМетилированиеандрогенногорецептораМетил-CpGсвязывающийбелок - частицаДетекцияспецифическогокомплексаBRET междугибриднымбелком икрасителемBOBO-3Интенсивностьбиолюминесценции на магнитныхчастицах,покрытых SAЧувствительностьСсылка25 нМ ДНК10-108 копийДНК до ПЦР[90]106-1011 копийДНК до ПЦРуровеньметилирования1-100%[59]2.4.

Биоаналитические системы на основе биолюминесцентногорезонансного переноса энергии (BRET) с использованиемлюциферазы2.4.1. Основные принципы BRETРезонансный перенос энергии (RET) - это безызлучательный перенос энергии от донорак акцептору, наблюдаемый только при их сближении на расстояние менее 10 нм. Длянаблюдения RET также необходимо перекрывание спектра эмиссии донора со спектромпоглощения акцептора и ориентация диполей донора и акцептора не должна составлять угол90°.При этом эффективность переноса описывается следующим уравнением:39E RET Гдеr-расстояниемеждудонором11  ( r R0 ) 6иакцептором,,R0-ферстеровскийрадиус–характеристическое расстояние, при котором эффективность переноса составляет 50% (20 - 50Ǻ), который определяется по формуле:R  [2.8 1017  2 QD A J ( )]1 6Где J-интеграл перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, кпараметр, зависящий от ориентации диполей, QD-квантовый выход донора, ε- коэффициентэкстинкции акцептора (М-1 см-1) [150].На практике RET проявляется в изменении регистрируемого спектра испускания:уменьшении интенсивности испускания донора и появлении спектра испускания акцептора.

Вслучае гибридизации молекулы донора с одним участником и молекулы акцептора с другимучастникомизучаемоговзаимодействияоткрываетсявозможностьмониторингамежмолекулярных, например, межбелковых взаимодействий в живых клетках, а такжеконформационных изменений в молекуле, если донор и акцептор локализованы на разных ееконцах, расстояние между которыми изменяется при конформационных изменениях.Соотношение интенсивности излучения акцептора к интенсивности излучения донора (RETсигнал) открывает возможности использования RET и для количественного анализа.Если функцию донора выполняет люцифераза, то резонансный перенос называютбиолюминесцентным (BRET).

В природе BRET встречается в морских организмах, таких какморские анютины глазки Renilla reniformis и медуза Aequorea victoria. В этих случаях функциюакцептора выполняет зеленый флуоресцентный белок, а донора - Renilla люцифераза (Rluc) илиакворин соответственно [130].Использование люциферазы в качестве донора имеет ряд преимуществ по сравнению страдиционным флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET), с использованием вкачестве донора флуоресцентного белка. В случае BRET нет необходимости во внешнемисточнике света, поэтому весь свет, излучаемый акцептором - это результат переноса энергии,что приводит к снижению фонового сигнала, при длине волны испускания флуорофораакцептора.Отсутствиенеобходимостифотообесцвечиванию образца иввозбуждающемсвететакжепрепятствуетоткрывает возможность использования в системах, гдетребуется работать с фоточувствительными клетками, а также клетками со значительнойавтофлуоресценцией при возбуждающем свете, необходимом для FRET (близкий УФ).

Болеевысокая чувствительность регистрации BRET-сигнала позволяет работать с более низкими40концентрациями белков, что помимо экономического преимущества приводит к минимизациинеспецифических взаимодействий между изучаемыми белками.Например, в работе [151] в качестве донора и акцептора были использованы тяжелые илегкие цепи вариабельных участков антител, меченые люциферазой и флуоресцентным белком,соответственно, вместо используемых в системе с FRET голубого и зеленого флуоресцентныхбелков.

При этом концентрации реагентов удалось снизить в 40 раз для донора и в 3 раза дляакцептора [151]. Это привело к снижению предела детекции антигена на два порядка (с 0,8 мМдля FRET до 7 нM для BRET) [128]. Наконец, оборудование, необходимое для детекции BRETпроще и дешевле, нежели для FRET, где требуется источник для создания возбуждающегоизлучения.Основной задачей при разработке BRET систем является правильный выбор пар доноракцептор с хорошо разделяемыми спектрами испускания донора и акцептора, хотямаксимальноеперекрываниеспектраиспусканиядонорасоспектромпоглощения(возбуждения) акцептора необходимо для высокой эффективности переноса энергии.2.4.2.

BRET-системы на основе Renilla люциферазыПервое применение BRET было описано в 1999 году. В данной работе Xu с коллегамиизучали взаимодействия белков (гомодимеризации), кодируемых циркадными генами KaiA иKaiB в цианобактериях [152]. В качестве донора была использована Renilla люцифераза λmax em =480 нм), в качестве акцептора - желтый флуоресцентный белок (мутант зеленогофлуоресцентного белка, λex = 511 нм, λmaxem= 525 нм) [152].

С этого момента количествопубликаций с использованием Renilla люциферазы стремительно возрастало [153]. Былисинтезированы новые субстраты для люциферазы, различные мутантные формы как Renillaлюциферазы, так и желтых флуоресцентных белков с улучшенными характеристиками. Взависимости от пары донор/акцептор сформировались следующие версии BRET: BRET1 классическая версия с использованием коэлентеразина в качестве субстрата для Renillaлюциферазы (MW = 36 кДа и λmax em = 480 нм) в паре с желтым флуоресцентным белком (λmax em= 530 нм) и различными его модификациями [152]; BRET2 – версия с использованием субстратаDeepBlueC-химическогопроизводногокоэлентеразина,биолюминесценции Renilla люциферазы в синюю область (λmaxemсмещающегоспектр= 395 нм) и различныхвариантов зеленого флуоресцентного белка, используемого в качестве акцептора (λex = 400 нм,λmaxem= 510 нм) [154]. BRET2 обладает лучшим спектральным разрешением пиковлюминесценции и эмиссии акцептора по сравнению с BRET1, что играет важную роль дляскринингового анализа, когда требуется высокое соотношение сигнал/шум.