Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 11

A.BRET- перенос энергии люциферазы P. pyralis (Ppy WT-TS) на красный флуоресцентный белок(mKate S158A), B. SRET- перенос энергии люциферазы P. pyralis (Ppy WT-TS) на красныйфлуоресцентный белок (mKate S158A) с последующим переносом энергии на краситель AlexaFluor 680, иммобилизованный на его поверхности [159].2.4.4. Аналитическое применение BRET на основе люциферазыСистемы для количественного анализа на основе BRET можно разделить на два типа.Первый тип, наиболее распространенный и широко используемый, включает в себя системы, вкоторых происходит необратимое пространственное разделение пары донор/акцептор вприсутствии аналита. Как правило, такие системы характерны для измерения протеазнойактивности, где донор и акцептор соединены линкером, содержащим специфическуюпоследовательность.

Под действием протеаз происходит уменьшение BRET сигнала.Подавляющее большинство таких систем было создано на основе люцифераз Renilla и еемутантных форм [164], для люцифераз светляков известны лишь единичные работы[159].Ко второму типу, можно отнести системы, в которых наоборот происходит ассоциациядонора и акцептора в присутствии аналита, которое сопровождается появлением илиувеличением BRET-сигнала. К таким системам можно отнести изучение посттрансляционноймодификации [97], детекцию различных эффекторов, индуцирующих взаимодействие междудонором и акцептором, и лигандов, связывающихся с рецепторами и индуцирующихвнутриклеточную передачу сигнала (инсулиновый рецептор) [165, 166] и многие другие, средикоторых можно выделить иммуноанализ [167].46Иммуноанализ на основе BRET.

Одним из перспективных и малоизученныхнаправлений использования биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET)является гомогенный ИФАИммуноанализ на основе BRET обладает рядом преимуществ перед классическимгетерогенным иммуноанализом: 1) отсутствие стадий разделения и отмывания несвязавшихсякомпонентов, 2) значительное сокращение времени анализа за счет условий его проведения вгомогенном растворе, что приводит к снижению диффузионных ограничений.Как и гетерогенный иммуноанализ, иммуноанализ на основе BRET можно разделить наконкурентный и неконкурентный.Принцип неконкурентногоанализа заключается вследующем: в отсутствие антител (антигена) белки BRET-системы (донор и акцептор)находятся в несвязанном состоянии и переноса энергии не наблюдается. При добавленииантител (антигена) в систему происходит образование тройного комплекса: донор-акцепторантитело (антиген).

При этом донор и акцептор сближаются настолько, что становитсявозможен резонансный перенос энергии, и появляется флуоресцентный сигнал (Рис. 11. A, B).При этом BRET-сигнал пропорционален концентрации антител (антигена), что и используетсядля количественного определения аналита [128].Принцип конкурентного иммуноанализа заключается в использовании аналита,конъюгированного с донором/акцептором и антител, конъюгированных с акцептором/доноромбиолюминесценции.

В отсутствие аналита наблюдается максимальный BRET-сигнал, которыйуменьшается пропорционально концентрации определяемого аналита, вводимого в систему[161].Примером пары донор/акцептор для неконкурентного иммуноанализа являютсягибридные белки легких и тяжелых цепей вариабельных участков антител к лизоциму куриногояйца с люциферазой Renilla Trx-VH–Luc (донор) и флуоресцентным белком Trx-VL–EYFP(акцептор). В структуру гибридных белков был добавлен тиоредоксин (Trx), улучшающий ихрастворимость при экспрессии (Рис. 11.A.).

Данная система позволяет определять 7 -700 нМлизоцима куриного яйца, что в 10 раз лучше, чем для аналогичного FRET [151].Еще одним примером, где в качестве донора используется уже люцифераза светляковHotaria parvula (HpL) является пара люцифераза-глутатион-S-трансфераза (GST-HpL) ифлуоресцентный белок-белок G (DsRed-PG), где белок G (PG) - это IgG-связывающий доменситафилококка, способный связываться с Fc-фрагментами антител [55]. Донор и акцептор былиполучены генноинженерным путем в клетках E. coli, очищены аффинной хроматографией.Данная пара была использована для определения концентрации антител к глутатион-Sтрансферазе (Ab) в диапазоне 0,1 нМ - 1 мкМ (Рис. 11.B).

В случае добавления пептидногоантигена между глутатионS-трансферазой и люциферазой, появляется возможность47использования данного гибридного белка для конкурентного анализа этого пептида. Эта идеябыла воплощена в работе [161] для определения с-myc пептида (онкогена) с использованиемгибридного белка GST-myc-Luc в качестве донора и антител, меченых цианиновым красителемCy 3 в качестве акцептора (Рис. 11.С). Диапазон измеряемых концентраций с-myc пептидасоставил 0,2 - 2 мкМ.А.B.C.Рис. 11. Схемы иммуноанализа с использованием биолюминесцентного резонансногопереноса энергии. A.

В отсутствие антигена гибридные белки находятся в форме мономеров иBRET не наблюдается, добавление антигена индуцирует гетеродимеризацию легких (VL) итяжелых (VH) цепей антител, что сопровождается появлением BRET от RLuс к EYFP [128]. B.В отсутствие антител гибридные белки находятся в форме мономеров и BRET не наблюдается,добавление антител индуцирует формирование тройного комплекса GST-HpL/Ab/DsRed-PG,что сопровождается появлением BRET от HpL к DsRed [55]. С. В присутствии гибридногобелка GST-myc пептид-люцифераза и окрашенных антител (Cy 3-Antibody) наблюдается BRETот люциферазы к красителю Cy3, который уменьшается при добавлении myc пептидапропорционально его концентрации [161].Важно отметить, что BRET в иммуноанализе может наблюдаться лишь в том случае,если расположение эпитопов, распознаваемых антителами обеспечивает необходимоесближение центра биолюминесценции люциферазы и центра поглощения акцептора приспецифической реакции антиген-антитело, то есть в первую очередь метод подходит длядетекции небольших молекул.

Ohiro с соавторами адаптировали метод на основе RET и длядетекции таких относительно больших молекул как сывороточный антиген человека, но сиспользованием FRET [168]. Модификация метода заключалась в искусственном введениидимеризационныхлейциновыхмотивов(c-JunилиFosB)наC-концыFRET-пары,способствующих более плотному сближению пары при иммунореакции, и, следовательно,улучшению эффективность FRET. Этот подход был использован для гомогенного сэндвичиммуноанализа сывороточного антигена человека, но для BRET пока похожего подходапредложено не было.48Стоит отметить, что в литературе известны лишь отдельные работы, посвященныеиспользованию люциферазы светляков в BRET-системах, особенно в иммуноанализе, однакопреимущества люцифераз светляков перед другими люциферазами, описанные выше,показывают,чтоэтонаправлениевесьмаперспективно.Поэтомусозданиеновыхвысокочувствительных биоаналитических систем на основе BRET с использованиемлюциферазы светляков является актуальной задачейАнализ литературы показывает, что люцифераза светляков по своим физико-химическимсвойствам имеет большой потенциал для применения в биоспецифическом анализе, который кнастоящему времени недостаточно реализован.

В связи с этим в настоящей работе поставленазадача создания новых реагентов на основе люциферазы светляков, для их дальнейшегоприменения в создании биоаналитических систем. Использование для этих целей люциферазысветляков L. mingrelica обусловлено тем, что сконструированы мутантные формы фермента сулучшенными свойствами по сравнению с люциферазой дикого типа: высокой каталитическойактивностью, термостабильностью; разработаны высокоэффективные методы экспрессии,экономичные и быстрые методы очистки препаративных количеств фермента. Эти особенностилюциферазы светляков L.

mingrelica позволяют получать реагенты (бифункциональныемолекулы) на ее основе для создания высокочувствительных биоаналитических систем.В связи с этим в настоящем исследовании были поставлены следующие задачи.Создание новых генноинженерных конструкций, позволяющих получать биотинилированнуюлюциферазу и стрептавидин-люциферазу путем их экспрессии в клетках E. coli. Применениеполученныхгибридныхбелковвбиоспецифическоманализенаосновебиотин-стрептавидиновых взаимодействий на примере различных вариантов гетерогенного анализа длядетекции клеток микроорганизмов.

Разработка метода получения высокоактивных конъюгатовлюциферазы с низкомолекулярными аналитами на примере прогестерона и создание на ихоснове новой системы для высокоэффективного биолюминесцентного резонансного переносаэнергии (BRET). Применение разработанной BRET-системы, позволяющей проводитьиммуноанализ низкомолекулярного антигена (прогестерона) в гомогенных условиях.493.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ3.1. Вещества и реагентыДля работы с ДНК были использованы следующие реагенты: рестриктазы AsuNHI, ApaI,SalI, KpnI, Bgl II («СибЭнизм», Россия), PstI, XhoI («Boehringer Mannheim», Германия); Pfu ДНКполимераза,TaqSEДНК-полимераза(«СибЭнзим»,Россия);смесьдезокси-нуклеотидтрифосфатов («СибЭнизм», Россия); T4 ДНК-лигаза, лигазный буфер, Taq ДНКполимераза («Силекс», Россия); минеральное масло (mineral oil, PCR Reagent) («ICN», США);агароза (Type I-A: Low EEO) («Sigma», США); бромидистый этидий («Amresco», США); ДНКмаркерыдляэлектрофореза(«СибЭнзим»,Россия);полилизин(«Sigma»,США).Олигонуклеотиды для проведения ПЦР были синтезированы в компании «Синтол», Россия.

ВработеиспользовалимагнитныечастицыпокрытыестрептавидиномStreptavidinC1(«Invitrogen», США), стрептавидин («Sigma», США), 3-O-карбоксиметилоксим прогестерона(«Sigma», США), ДЦК («Sigma», США), N-гидроксисукцинимид («Pierсe», США), глутаровыйальдегид («Sigma», США), полистирольные частицы диаметром 240 нм 10%-ная суспензия вдеионизованной воде («Bangs Laboratories, Inc.», США), плюроник F108-PDS («AllvivoVascular», США); 2-иминотиолан гидрохлорид (реагент Траута), бычий сывороточныйальбумин(BSA),тритонX-100,неонол-10,дитиотреитол(ДТТ),трис(гидроксиметил)аминометан (Трис), натриевую соль ампициллина («ICN», США); Твин-20,бакто-агар («Ferak», Германия); дитиотреитол («Fluka», Швейцария); дрожжевой экстракт,лактоза моногидрат («Panreac», Испания); имидазол, NiSO4 («Sigma», США); MgSO4.7H2O,NaCl, NaH2PO4.H2O, Na2HPO4.7H2O, KCl, MgCl2 додецилсульфат натрия, глюкоза моногидрат(«Хеликон», Россия); (NH4)2SO4 («BDH Laboratory Supplies», Англия); бакто-триптон («BectonDickinson», Франция); уксусную кислоту, соляную кислоту, ацетат аммония; перегнанныеэтиловый спирт, глицерин и диметилсульфоксид («Реахим», ос.