Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 12

ч.); NaHCO3, прочиенеорганические соли («Союзхимреактив», Россия). Были использованы моноклональныебиотинилированные и небиотинилированные антитела SB:1B10B к сальмонелле серогруппы В,любезно предоставленные д.б.н. С.Г. Аббасовой (ИБХ РАН, Пущино, Россия). Поликлональныекроличьи антитела к прогестерону, конъюгат вторичных антивидовых антител с пероксидазой,белок А любезно предоставленные к.х.н., с.н.с.

Ж.В. Самсоновой, конъюгат стрептавидинпероксидаза (« Иммунотех», Россия). Были использованы субстраты люциферазы: динатриеваясоль ATP («Sigma», США); люциферин светляков («Люмтек», Россия). Были использованыследующие носители для хроматографии и колонки: сефадекс G-25 («Pharmacia», Швеция); 1мл колонки HiTrap FF с IDA-сефарозой («GE HealthCare», Швеция); колонка SUPEROSE 125010/300 GL («GE HealthCare», США). В Таблице 9 указан состав сред и растворов,применявшихся для выращивания клеток E. coli.Таблица 9. Использованные среды и растворы.Среда или растворСоставLB1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, pH 7.0SOB2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,05% NaCl, 2,5 мМ KCl, 10мМ MgCl2, pH 7.0socSOB + дополнительно 20 мМ глюкозыZY1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, pH 7.020xNPS0,5 М (NH4)2SO4, 1 М KH2PO4, 1 М Na2HPO450x505225% глицерин, 2,5% глюкоза, 10% лактоза моногидрат1000xMg1 М MgSO41 М раствор сульфата магния и 2 M раствор глюкозы стерилизовали фильтрованиемчерез фильтр 0,22 мкм.

Растворы LB, SOB, ZY, 20xNPS, 50x5052 стерилизовалиавтоклавированием при 0,5 атм. в течение 30 мин при температуре 121°С. Послеавтоклавирования к средам SOB и SOC добавляли стерильные растворы MgCl2 и глюкозысоответственно до необходимой концентрации. В работе использовали следующие буферныерастворы (Таблица 10). Все растворы готовили с использованием высокоочищеннойдистиллированной деионизованной воды, полученной на установке WaterPro Plus («LabConco»,США).Таблица 10.

Состав буферных растворовБуферныйpH, (25°C)СоставрастворДля измерения люциферазной активностиAB7,80,05 М Трис-ацетат, 10 мМ MgSO4,2 мМ ЭДТАATP7,84 мМ ATP, 0,05 М Трис-ацетат, 10 мМ MgSO4,2 мМ ЭДТАLH27,80,5 мМ люциферин, 0,0510 мМ MgSO4, 2 мМ ЭДТАМТрис-ацетат,510,025 М КН2РО4, 0,025 M К2НРО4, 2 мМ ЭДТА,7,5 мМ MgSO4, 1 мМ АТР, 0,15 мМ LH2, 1 %Неонол-10, 50 мкМ Na4P2O7Субстратная смесь7,8ATP-LH2Для очистки люциферазыHB17,520 мМ имидазол, 20 мМ Na-фосфат, 500 мМ NaClHB37,5300 мМ имидазол, 20 мМ Na-фосфат, 500 мМ NaClHB47,5500 мМ имидазол, 20 мМ Na-фосфат, 500 мМ NaClGF27,350 мМ Трис-ацетат, 100 мМ Na2SO4, 2 мМ ЭДТА1М DTT5,21М DTT в 10 мМ Na-ацетатном буфереДля изучения термоинактивации люциферазы7,80,05 М Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgSO4.TB1Для приготовления компетентных клеток10 мМ Pipes (или Hepes), 75 мМ CaCl2, 250 мМТВ6,7KCl, 55 мМ MnCl2TB + глицерин6,7Для электрофореза ДНК50хТАЕ8,5Аналогично TB, но дополнительно 20 % глицерин2 М Трис-ацетат, 50 мМ ЭДТАДля конъюгацииB17,50,02 М Na-фосфат, 0,15 М NaCl, 1 мМ ЭДТАB27,50,01 М Na-фосфат, 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТАPBSS7,80,01 М Na-фосфат, 0,15 М NaCl, 10 мМ MgSO4, 2мМ ATPДля иммуноферментного анализаNCA9,60,01 М NaHCO3PBS7,40,01 М Na-фосфат, 0,15 М NaClPBST7,40,01 М Na-фосфат, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин-20PBS-BSA7,40,01 М Na-фосфат, 0,15 М NaCl, 1% BSAPBST-BSA7,40,01 М Na-фосфат, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин-20,1% BSAДля гибридизационного анализа0,31 M Na2SO4, 0,25 M Na2HPO41×SpB2 x SSPE7,40,02 M NaH2PO4∙H2O, 0,3 M NaCl, 0,002 M ЭДТА,523.2.Штаммы и плазмидыДля генно-инженерных работ использовали штамм E.

coli XL1-Blue (recA1 endA1 gyrA96thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIq ZΔM15 Tn10 (Tetr)] («Stratagene», США). Длянаработки и выделения ферментов, содержащих His6 на C-конце, использовали штамм E. coliBL21(DE3)CodonPlus (E. coli B F- ompT hsdS(rB-mB-) dcm*Tetrgal λ (DE3) endA Hte) («Stratagene»,США).

Для конструирования плазмид были использованы следующие плазмиды: pETL7,pET23b [169], pETL4 [170], плазмида, содержащая ген люциферазы дикого типа с мутациямиG216N/A217L/S398M [171], плазмида MT3 [172]. Минимальный участок гена стрептавидина(119 ам.о.) из полного гена стрептавидина был любезно предоставлен к.х.н., с.н.с. В. Г.Григоренко. Для проведения иммуноферментного анализа были использованы клеткиSalmonella typhimurium CRIFS № C1058, которые были получены из коллекции КанадскогоИсследовательского Института по Безопасности Пищи (СRIFS).3.3.АппаратураИнтенсивность биолюминесценции в отдельных лунках стрипованного планшета ипробирках регистрировали на люминометре FB 12 Femtomaster «Zylux Corp» («Bertold»,Германия), в отдельных лунках стрипованного планшета на люминометре ЛЮМ-1 (ООО«Люмтек»,Россия).Спектрыбиолюминесценцииифлуоресценцииснималиналюминесцентном спектрометре LS 50B («Perkin-Elmer», Англия) и планшетном спектрометреSpectramax M5 («Molecular Devices», США).

Спектрофотометрические измерения проводили наспектрофотометре UV-1202 («Shimadzu», Япония) и Lambda 35(«Perkin-Elmer», Англия).Измерения рН проводили на рН-метре МР-220 («Mettler Toledo», Англия) с точностью до0,01 ед. рН. Микробиологические эксперименты проводили под ламинаром GS («Babcock»,Германия). Чашки Петри с клетками инкубировали в термостатах Certomat H («Sartorius-BBI»,Германия). Культуру клеток E. coli выращивали на термостатируемой качалке SI-300R («JEIOTECH», Южная Корея).

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторах Терцик(ДНК- Технология, Россия) или Mastercycler Gradient («Eppendorf», Германия). ЭлектрофорезДНК проводили в камере HE-33 («Serva», Германия) с источником питания EPS 2A200(«Hoefer», США). Визуализацию ДНК в геле проводили на трансиллюминаторе TM-36 (302 nm)(«UVP», США).При очистке люцифераз использовали хроматографические колонки (Pharmacia,Швеция), перистальтический насос и коллектор фракций Ultrorac-1000, холодильную камеруMiniColdlab («LKB», Швеция). Анализ олигомерного состава белков проводили нахроматографическойсистемеÄKTApurifier10(«GE»,США).Электрофорезбелковосуществляли на приборе Mini-Protean II Cell («BioRad», Австрия).

Центрифугирование53проводили на центрифугах J2-21 (роторы JA-20 для пробирок на 50 мл и JA-14 для пробирок на250мл)(«Beckman»,США)иCentrifuge5415C(«Eppendorf»,Германия).Длятермостатирования образцов использовали водяной термостат 2209 Multitemp («LKB», Швеция)или твердотельный термостат «Гном» («ДНК-Технология», Россия). Для иммуноферментногоанализа использовали стрипованные 96-луночные иммунологические планшеты средней ивысокой сорбции («Greiner», Германия), а также белые 96-луночные иммунологическиепланшеты средней сорбции Microlite 2+ («Thermo», США) Ячейки инкубировали приперемешивании в термостатируемом шейкере-инкубаторе ES-20 («Biosan», Латвия-Англия),либо термомиксере comfort («Eppendorf», Германия).

Эппендорфы с растворами и суспензиямиперемешивали на мини-ротаторе Bio RS-24 («Biosan», Латвия-Англия). Иммобилизацию зондовпроводили в гибридизационной печи HM-4000 («UVP», Великобритания). Оптическуюплотность в ИФА с использованием пероксидазы измеряли на планшетном фотометре EpsonLQ-1050 («Moleqular devices», США)3.4.Методики проведения экспериментов3.4.1. Методы работы с ДНКВыделение плазмид. Выделение и очистку плазмидной ДНК из клеток E. coli проводилисогласно модифицированному варианту метода щелочного лизиса [173].Электрофорез в агарозном геле.

Электрофорез проводили в 1 или 1,5% агарозном гелес концентрацией этидиум бромида 0,5 мкг/мл в буферном растворе ТАЕ. Образцы дляэлектрофореза готовили, добавляя пробы ДНК объемом от 1-5 мкл (качественный форез) до 18мкл (препаративный форез) к 2 мкл 10х буфера для нанесения пробы (0,25% бромфеноловогосинего, 50% глицерина, 0,1М ЭДТА). Электрофорез проводили при 80 мА в течение 30-40минут при комнатной температуре.Элюция образцов ДНК из геля и их очистка. Элюцию фрагментов ДНК из агарозногогеля проводили с помощью набора QiaexII фирмы Qiagen согласно инструкции производителя,либо методом заморозки-разморозки [174], что упрощало процедуру, но приводило к низкомувыходу ДНК.

Второй способ применяли для лигирования и ПЦР, когда не было необходимостиочищать ДНК от буфера TAE и микропримесей агарозы. Фрагмент ДНК в агарозном гелепомещали в пробирку, замораживали при -80°C и после этого размораживали, повторяли этуоперацию ещё два раза. Затем гель осаждали на центрифуге при 12000 g в течение 2 минут иотбирали жидкость над гелем, содержащую ДНК.Секвенирование ДНК.

Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском центреколлективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН с помощью набора реактивов ABI PRISM®54BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическомсеквенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant.Приготовление компетентных клеток E. coli.Компетентные клетки готовили согласно методике, описанной в работе [175]. Спомощью стерильной петли отбирали свежую колонию клеток E. coli диаметром 2-3 мм счашки Петри с агаризованной средой SOB (1,5% агара) и инокулировали в колбу со средой SOB(объем среды – не более 100 мл на колбу объемом 1 л).

Клеточную культуру растили натермостатируемой качалке при 37°C, 180 об/мин в течение 2,5-3 ч до A600 ≈ 0,2-0,4. Клеткиосаждали центрифугированием (2700g, 10 мин, 4°С). Осадок ресуспендировали в буфере, объёмкоторого составлял 1/2 от исходного объёма клеточной культуры. Полученный растворинкубировали во льду в течение 25 мин, затем вновь осаждали клетки центрифугированием(2700g, 10 минут, 4°С). Полученный осадок растворяли в буфере TB, содержащем 20%глицерина.Объембуферасоставлял1/10исходногообъемаклеточнойсуспензии.Инкубировали во льду 15 минут. Затем разливали в микропробирки типа эппендорф по 100 мкли хранили при -80°С.Трансформация компетентных клеток E.

coli. К 100 мкл (или 25-50 мкл ссоответствующим пересчетом) компетентных клеток добавляли 0,5÷4 мкл раствора ДНК.Добавляли 1 мкл 40% раствора PEG-8000, перемешивали. Инкубировали во льду 30 мин.Помещали пробирки в водяную баню с температурой 42°C на 90 с, быстро охлаждали во льду(2 мин). Добавляли 400 мкл среды SOC, инкубировали при 37°C при умеренном перемешиваниив течение 45 мин. Затем клетки высеивали на чашки со средой LB, содержащей 100 мкг/млампициллина, и инкубировали 12-16 ч при 37°C.3.4.2. Конструирование плазмидКонструированиеплазмиды,кодирующейгибридныйбелокLuc-bccp.Гентермостабильного мутанта люциферазы Luciola mingrelica [176], выделяли из плазмиды pETL7[176] при помощи рестрикции по сайтам Pst I, Apa I.