Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 13

Фрагмент ДНК, кодирующий 87 Сконцевых аминокислотных остатков биотин-связывающего белка (bccp) [177], выделяли изгенома клеток E. coli и модифицировали сайтами рестрикции SalI и ApaI при помощи ПЦР сиспользованием следующих праймеров:прямой праймер bccp: 5’- TCGGGCCCATTGGAAGCGCCAGCAGC -3’ (26 bp)обратный праймер bccp: 5'- GTGGTCGACACCCTCGATGACGACCAGCGG -3' (30 bp)После очистки оба фрагмента лигировали в вектор pET23b («Novagen», США),разрезанный по сайтам PstI и XhoI [178]. «Липкие концы» сайтов SalI и XhoI совместимы, и55после лигирования оба сайта исчезают. Клетки XL1-blue были трансформированы полученнойплазмидой, которая была наработана в необходимом количестве.Получение плазмид, кодирующих гибридные белки стрептавидин-люцифераза. Дляполучения плазмид использовали ген TS люциферазы Luciola mingrelica [176] и минимальныйучасток гена стрептавидина (119 ам.о.) Streptomyces avidinii, любезно предоставленного В.

Г.Григоренко. При этом к С-концу стрептавидина был добавлен полипептид SGGGS. В начале иконце нуклеотидной последовательности были введены сайты рестрикции NdeI и NcoI, сиспользованием следующих праймеров:прямой 5'- TTATATTAACATATGGGCATCACCGGCACCTGGTAC -3' иобратный 5'- TTCCATGGAACCGCCACCAGACACCTTGGTGAAGGTGTCG -3'.ПЦР продукт был обработан по соответствующим сайтам рестрикции. Далее изплазмиды pJGtrc [179], был вырезан начальный участок гена люциферазы по сайтам NcoI иBamHI. Фрагменты NdeI-NcoI и NcoI-BamHI субклонировали в вектор pETL7 (GenBank No.HQ007050), содержащий ген TS люциферазы [180], по сайтам NdeI и BamHI.

В результатеполучили плазмиду, кодирующую белок SA-Luc-His6. На основании этой плазмиды былаполучена плазмида SA-Luc-His6M/G с заменой в гене люциферазы стартового кодона Met на Gly.Для этого фрагмент плазмиды SA-Luc-His6, содержащий ген стрептавидина и регуляторныйучасток t7-промотора, амплифицировали методом ПЦР с использованием следующихпраймеров:прямой 5´- TAATACGACTCACTATAGGG- 3´обратный 5'- CAAAAGCTTGGAACCGCCACTAGACACC -3'При этом был введен сайт рестрикции Hind III (подчеркнут).

Полученный ПЦР-фрагментразрезали по сайтам рестрикции NdeI и Hind III и субклонировали в вектор BsAp 4TS-Lml-pETL7[181]. Для получения плазмиды His6-SA-Luc из плазмиды SA-Luc-His6 вырезали фрагмент NdeBglII, содержащий ген стрептавидина и часть гена люциферазы. Из плазмиды pETL4 [172]вырезали фрагменты BglII-Pst, PstI-NdeI, которые лигировали с фрагментом Nde-BglII.Для получения плазмиды Luc-SA-His6 ген стрептавидина амплифицировали методомПЦР со следующими праймерами:прямой 5'- TCGGGCCCATCTGGTGGAGGTGGCAGTGCAGGCATCACCGGCACCTGG -3'обратный 5'- GTGCTCGAGACCCACCTTGGTGAAGGTGTCGTGG -3'.В начале и конце нуклеотидной последовательности были введены сайты рестрикции ApaI иXhoI, соответственно (подчёркнуты).

С N-конца стрептавидина был добавлен полипептидGPSGGGGSA, а с C-конца – полипептид GVE. ПЦР продукт обработали по соответствующимсайтам рестрикции (ApaI и XhoI). Далее из плазмиды pETL7 вырезали ген TS люциферазы посайтам рестрикции NheI и ApaI. Фрагменты NheI-ApaI и ApaI-XhoI субклонировали в вектор56pETL7 по сайтам NheI и XhoI. В результате получили плазмиду, кодирующую белок Luc-SAHis6, который содержит линкер SGGGGSA между генами люциферазы и стрептавидина, а такжеполипептид GVEHHHHHH на C-конце (His6).Для всех полученных плазмид был проведен анализ нуклеотидных последовательностей,кодирующих гибридные белки методом секвенирования.Получение плазмиды, кодирующей зеленый мутант люциферазы GLuc.

Дляполучения плазмиды, кодирующей зеленую форму термостабильной люциферазы в генлюциферазы TS были введены две замены S398M и Y35N. Для этого использовали следующиеплазмиды: 1) плазмида, содержащая ген «люциферазы дикого типа» с мутациямиG216N/A217L/S398M [171], 2) плазмида MT3 [172], кодирующая ген «люциферазы дикоготипа» с заменой Y35N, 3) pETL4 [172], кодирующая ген термостабильной люциферазы.Мутацию S398M вводили следующим образом: фрагмент Bpu 14I-Bgl II плазмиды pETL4[172],кодирующийучастокгеналюциферазысмутациями,отвечающимизатермостабильность, лигировали с фрагментом Bgl II-Bpu 14I, плазмиды с мутациямиG216N/A217L/S398M [171], содержащим фрагмент гена люциферазы с заменой S398M ирегуляторные элементы. Полученную плазмиду разрезали по сайтам Bpu 14I и Apa I иклонировали в вектор MT3 по тем же сайтам рестрикции, содержащим мутацию Y35N в генелюциферазы дикого типа.

Из полученной плазмиды TS+S398M+ Y35N вырезали генлюциферазы по сайтам Apa I и Nhe I и клонировали в вектор pETL4 по тем же сайтамрестрикции.3.4.3. Получение гибридных белков Luc-bccp, Luc-SA и термостабильнойлюциферазы L. mingrelica, содержащих His6-последовательностьВыделение гибридных белков и люциферазы. Наработку фермента проводили в средеZYP-5052 по методу автоиндукции с лактозой, разработанному Стадиером [182]. Дляполучения 200 мл среды ZYP-5052 непосредственно перед использованием в 1 л колбупомещали ~186 мл среды ZY, добавляли 200 мкл 1M MgSO4 и 4 мл и 10 мл растворов 50x5052,20xNPS соответственно. На чашку со средой LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина и 1,5%бакто-агара, высеивали клетки E.

coli BL21(DE3) CodonPlus, несущие одну из вышеуказанныхплазмид, и инкубировали в течение ночи при 37°C. 2-3 колонии инокулировали в бакпечатку с 3мл среды LB со 200 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы, растили 3 - 6 часов на качалке при37°C, 180 об/мин, пока суспензия клеток не становилась мутной (A600 = 0,4÷1). Разбавляликультуру до A600~0,0024, внося рассчитанный объем клеточной культуры в 1 л колбу с 200 млсреды ZYP-5052, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.

Инкубировали на качалке ~2 ч при37°C, 180 об/мин, пока суспензия не становилась слегка мутной (А600=0,2 ÷ 0,5). Затем растили57ещё 15-18 часов при 23°C до А600 = 5÷9. Клетки осаждали центрифугированием (5500 g, 10 мин,4°C). Осадок ресуспендировали в 18-20 мл буфера HB I, содержащего 20 мМ имидазол и 0,5%Тритон X-100, разрушали клетки ультразвуком (6 циклов по 30 с через 1 мин),центрифугировали (39000 g, 30 мин, 4°C).Надосадочную жидкость (~20 мл) при 4°C наносили на 1 мл Ni-IDA колонку, промывали20-40 мл буферного раствора HB1. Фермент элюировали буфером HB3.

В полученный растворлюциферазы добавляли ЭДТА до концентрации 2 мМ и раствор дитиотреитола в 10 мМ Naацетатном буфере, pH 5.2 до концентрации 1 мМ. Хранили при 0°C.Электрофорез гибридных белков и исходной люциферазы в ПААГ по Лэмли [183]проводили в денатурирующих условиях.

В 4%-ном концентрирующем и 7%-ном разделяющемгелях. Подаваемое напряжение составляло 60 В и 120 В в концентрирующем и разделяющемгелях соответственно. Проявление белковых полос проводили с помощью красителябромфенолового синего.3.4.4. Изучение свойств гибридных белков Luc-bccp и Luc-SAОпределение активности гибридных белков и исходной люциферазы определяли налюминометре по величине максимальной интенсивности света (Imax), излучаемого в процессеферментативной реакции, при насыщающих концентрациях субстратов путем добавления 5 мклраствора люциферазы или гибридного белка в буфере AB в кювету, содержащую 350 мкл 1,7мМ раствора ATP в том же буфере. Далее инжектировали 150 мкл 0,5 мМ раствора люциферинав буфере AB и регистрировали интенсивность биолюминесценции.

Активность выражали в9относительных единицах, RLU. Одна RLU = 10 квант/с.Концентрациюгибридныхбелковиисходнойлюциферазыопределялипопоглощению раствора при 280 нм на спектрофотометре Shimadzu UV 1202. В качестве1мг/млкоэффициентов поглощения A1смиспользовали значения 0,55 для исходной люциферазы,0,51 для гибридного белка люцифераза-bccp, 1,0 для гибридных белков люциферазастрептавидин. Коэффициенты были рассчитаны на основе аминокислотной последовательности1мг/млс помощью программы ProtParam сервера ExPASy [184] A1см= 0,509 .

http://web.expasy.org/protparam/Определение констант Михаэлиса по люциферину и ATP. Величину KmLH2 определялииз зависимости максимальной интенсивности биолюминесценции (Imax) от концентрациилюциферина (8-300 мкМ) при постоянной концентрации ATP (1,2 мМ), а KmATP – из зависимостиImax от концентрации ATP (96-1900 мкМ) при постоянной концентрации люциферина (0,15 мМ).Эти диапазоны концентраций находятся в районе 0,3-10 KmLH2 и 0,4-7 KmATP соответственно.Значения Km для люциферина и ATP рассчитывали с помощью программы OriginPro 7.558(«OriginLab», США) методом нелинейной регрессии с использованием уравнения МихаэлисаМентен.

Чтобы не прибегать к последовательным разбавлениям раствора фермента приизмерении активности, световой поток уменьшали с помощью светофильтра, помещённого наразделительное стекло в кюветном отделении люминометра FB12. Концентрация растворагибридного белка люциферазы при определении значений Km, составляла 0,01 мг/мл.Спектры биолюминесценции регистрировали на спектрометре Spectramax M5 в режиме«биолюминесценция». В лунки белого стрипованного полистирольного планшета помещали 10мкл раствора, содержащего 10-9 М гибридного белка и 90 мкл субстратной смеси ATP-LH2предварительно разбавленной в 1,8 раз буфером PBST, быстро перемешивали и регистрировалиспектры биолюминесценции в интервале 480-700 нм.Изучение термостабильности гибридных белков и исходной люциферазы.