Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 8

Специфические взаимодействияв присутствии аналита приводят к восстановлению целостности молекулы люциферазы, а,следовательно, появлению биолюминесценции. Частным случаем являются системы сиспользованием гибридных белков суперскрученных белков и люциферазы с циклическойперестановкой, которые в основном используются для детекции протеазной активности [101]2.3.1. Применение конъюгатов и гибридных белков на основе люциферазысветляков в гетерогенном ИФАВ данном разделе рассмотрены системы первого типа, в которых специфическиедомены, связанные с люциферазой, приводят к ее фиксации на поверхности мишени (антигена,антитела, ДНК, РНК) без изменения ее физико-химических свойств и измерении еебиолюминесцентногосигнала.Восновномэторазличныевариантыгетерогенногоиммуноанализа (одностадийный или двухстадийный, конкурентный или неконкурентный).Средиреагентовдляиммуноанализанаосновелюциферазынаибольшеераспространение получил универсальный гибридный белок биотинилированной люциферазы bl248 фирмы Киккоман [120] в виде нековалентно-связанных комплексов, образованных биотинстрептавидиновыми взаимодействиями, с антителами (Рис.

7 А, В) или их фрагментами (Рис. 7С), либо антигенами [131].33А [119, 132],Рис.7.В [133, 134],ВозможныенековалентныеC [135, 136],комплексыантителсбиотинилированнойлюциферазой.Были получены различные варианты комплексов люцифераза-антитела, стабильностькоторых зависела от структуры. Так комплекс (Рис. 7 А), описанный в работах [119, 132], всекомпоненты которого связаны через биотин, отличался невысокой стабильностью - менее 30%люциферазной и иммунологической активности комплекса сохранялось после инкубации при37 °С в течение недели [133]. Использование ковалентной связи между антителом истрептавидином (Рис.

7 B), привело к значительному повышению стабильности комплекса [133,134]. При тех же условиях инкубации сохранялось до 70% от исходной люциферазной ииммунологическойактивностикомплекса.Стоитотметить,чтотолько4,7%биотинилированной люциферазы диссоциировало при инкубации в течение недели, такаявысокая стабильность характерна для химически полученных конъюгатов антител спероксидазой и фосфатазой. При хранении в течение 6 месяцев при 4◦C в концентрации 1 нМкомплекс сохранял 100% активности [133].Рассмотренные выше комплексы находят применение для определения широкогоспектра аналитов: различные гормоны [131], белки [119, 132], вирусы [136], патогенныемикроорганизмы и их поверхностные антигены (Таблица 6).

Для сравнения в таблицеприведены данные и для конъюгатов люциферазы и фотопротеинов с биотином [68] в составенековалентных комплексов с антителами, а также конъюгатов люциферазы [75] и пероксидазыс антителами.Согласно литературным данным, анализ на основе биолюминесцентного методадетекции обладает более высокой чувствительностью (предел обнаружения в 50-100 раз ниже)по сравнению с иммунохороматографическим методом [137] и ИФА с использованиемпероксидазы [136], однако, уступает радиоиммуннологическому анализу (предел обнаружениятиреотропного гормона в 20 раз ниже [134]) и RT-ПЦР (предел обнаружения 104 копий ДНК/гобразца) [138, 139].

При этом структура комплекса Luc-Ab , полученного с использованиембиотинилированной люциферазы или фотопротеина (Luc-bccp-b--SA--Ab), стрептавидинлюциферазы (Luc-SA--Ab) или конъюгата с антителами (Luc-Ab) не оказывает существенноговлияния на чувствительность [68]. Была получена хорошая корреляция результатов,34полученных при использовании различных методов.

Использование магнитных частицзначительно сокращает время проведения анализа. Стоит отметить, что в работах [119], [132]использование двух биотинилированных люцифераз, излучающих в различных областяхспектра позволило провести одновременное определение концентрации двух аналитов в однойсмесисиспользованиемсоответствующихфильтров,чтооткрываетвозможностииспользования люцифераз в мультиплексном анализе.Таблица 6.

Использование биотинилированной люциферазы в комплексе со стрептавидином вгетерогенном ИФАМетодДетектирующий комплексАнтигенВремяанализаДиапазонопределяемыхконцентрацийСсылкаКонкурентный ИФА намагн. чS- эквол- -SAb-bccp-LucЭквол(фитоэстроген)45 мин960-3700 нМ[131]2- хстадийныйсэндвичИФА напланшетеAb-b-SA-bАкворинCypridina-bSAHRP -AbАльфафетопротеин1,5 ч0,15-1500 пМ[68]α-интерферон3,5 ч0,4–25 пМ[76]3,5 чРис.

7BAb-SA- b-LucAb-LucРис. 7АPG I и PG II15 минРис. 7BРис. 7CHRP -AbПСАВирусный антигенгепатита В15 мин30 мин1,5 чРис. 7СКапсидный антигенноровируса30 мин1,25-50 пМ0,0025–200мкед./мл0,25-8 пМ0,07-1,2 нМ0,05–5 нМ PG I,0,025–2,5 нМ PG II0.01 пМ– 3,6 нМ0,0025-125 ед/мл12,5 мед/мл0,25-10000 пкг/мл,7,1 × 105 копий/г,1,5 × 104 частиц/мл[76]Одностадийный сэндвичИФАα-интерферонТиреотропныйгормонТропонинКреатинкиназа2-хстадийныйсэндвичИФА намагнитныхчастицах15 мин15 мин15 мин[134][75][75][119],[132][133][136][136][135]ИФА наHRP -Ab1,5 ч106-107 копий/г[140]Капсидный антигенпланшетеноровирусаИммунохроHRP -Ab[137,20 мин4.5 × 106 копий/млматография141]Обозначения: HRP - пероксидаза хрена, b - биотин, PG I и PG II - сывороточный пепсиноген Iи II типов, ПСА- простатаспецифичный антиген.Особенностоитотметитьиспользованиебиотинилированнойлюциферазыдляспецифического определения патогенных микроорганизмов в суспензии клеток, основанного надетекции их антигенов (белок А, белок G [142], липополисахариды [143] и др.) сиспользованием гетерогенного иммуноанализа, и для дифференциации штаммов, устойчивых ивосприимчивыхкдействиюантибиотиков.Вкачествепримераможнопривести35дифференициациюметициллин-резистентногоиметициллин-восприимчивогоштаммаStaphylococcus aureus, путем детекции пенициллин-связывающего белка 2 и 2’ (уникальногомаркера), экстрагированных из мембраны Staphylococcus aureus, с использованием сэндвичиммуноанализа.

Предел обнаружения пенициллин-связывающего белка 2 составил 50 пг/мл, абелка 2’-500 пг/мл [144].Методы детекции патогенных микроорганизмов или их поверхностных антигенов сиспользованием биотинилированных антител и комплекса биотинилированной люциферазы сострептавидином не отличаются высокой чувствительностью - минимальная детектируемаяконцентрация клеток составляет ~5×104-5×105 КОЕ/мл. Для определения более низкихконцентраций требуется предварительное культивирование клеток в селективной среде, чтоувеличивает длительность анализа.

Так, Фукуда с соавторами [16] детектировали присутствие вобразце ~50 КОЕ/мл клеток Staphylococcus aureus после 7 ч культивации [142]. Авторы работы[17] разработали метод 24-часового биолюминесцентного иммуноанализа клеток Salmonella всмывах тушек цыплят, а в работе [143] был оптимизирован состав среды для культивирования иулавливающий агент, иммобилизованный на поверхности планшета (вместо моноклональныхантител к поверхностным антигенам клеток Salmonella был использован полимиксин B), однакопредел обнаружения после культивации оставался довольно высоким (5×105 КОЕ/мл сиспользованием антител и 5×104 КОЕ/мл с использованием полимиксина B) [143].2.3.2. Применение гибридных белков на основе люциферазы светляков дляопределения ДНК или РНКАльтернативным методом детекции патогенных микроорганизмов являются методы наоснове ПЦР, позволяющие амплифицировать целевую ДНК в необходимое количество раз,однако их использование в некоторых случаях затруднено ингибированием полимеразыкомпонентами, которые входят в состав образца.

Кроме того, для дифференциацииспецифического и неспецифического ПЦР-продукта требуются дополнительные стадииразделения [145] или использование специфической метки, способной связываться только сцелевым участком ДНК, в частности, гибридных белков на основе люциферазы светляков сДНК или РНК-связывающими доменами, свойства которых описаны выше.Принцип анализа заключается в детекции специфических комплексов, образованныхфрагментами целевой ДНК, амплифицированными методом ПЦР, и гибридным белком наоснове люциферазы, распознающим специфический участок в ее составе. В некоторых случаяхнастадииПЦР-амплификациивводятбиотиндлявозможностииммобилизацииамплифицированной ДНК на поверхности планшета или магнитных частиц, покрытойстрептавидином (Рис. 8).36Данный метод позволяет селективно определять такие патогены как Legionellapneumophila , Salmonella, E.

coli O157 и другие coli-формы в присутствии посторонних геномов,а также вирусы, например, Norovirus с пределом обнаружения от 10 копий геномнойДНК/проба перед реакцией ПЦР. При этом предел обнаружения для анализа на основелюциферазы в 100 раз ниже, по сравнению с таким же анализом, но с использованиемпероксидазной метки [58] (Таблица 7).Рис. 8. Схема детекции целевой ДНК с использованием гибридного белка на основелюциферазы.Таблица 7. Использование гибридных белков на основе люциферазы светляков длядетекции патогенных микроорганизмов.Гибридный белокАналитD12H-LucGST-Zif268– LucРНК (UUAGGG)4Escherichia coli O157SA-Zif268– LucEscherichia coliSA-Zif268– LucSalmonellaGST-Sp1– LucLegionella pneumophilaGST - Sp1---антитела к Influenza A virusGST-пероксидазаGST- B2– LucNorovirusПределобнаружения,количество ДНК до и послеПЦР3·1013 копий100 копий, 100-1041010-1013 копий после ПЦР10 копий10-106 копий после ПЦР10 копий10-106 копий после ПЦР10 копий1010 (1,7 пМ) копий послеПЦР1012 (170 пмоль) копий послеПЦРнет данныхСсылка[129][58][56][56][58][57,58][56]Обозначения: GST-глутатион S-метилтрансфераза, см.