Гибридные белки и конъюгаты на основе люциферазы светляков Luciola mingrelica и их биоаналитическое применение, страница 10

Недостатком BRET2является то, что, что интенсивность биолюминесценции уменьшается в 300 раз при41использовании в качестве субстрата DeepBlueC. Это частично удалось преодолеть получениеммутантной формы RLuc8 (eBRET2) [155], квантовый выход которой был в 32 раза выше посравнению с исходной люциферазой, однако сигнал остался по-прежнему ниже, чем в BRET1.2.4.3. BRET-системы на основе люциферазы светляковНесмотря на неослабевающий интерес к Renilla люциферазе, она обладает рядомнедостатков, таких как: низкий квантовый выход и менее стабильное свечение по сравнению слюциферазой светляков; максимум спектра биолюминесценции наблюдается в зеленой областидлин волн, что затрудняет регистрацию сигнала в тканях, что связано с низкой проникающейспособностью зеленого света.

Кроме того стоит отметить, что уровень автофлуоресценцииклеток при длинах волн, характерных для эмиссии Renilla люциферазы выше, чем длялюцифераз светляков, для которых максимум биолюминесценции находится в области 540-630нм в зависимости от структуры фермента [156].Первые работы с использованием люциферазы светляков (λmaxem= 560-580 нм) вкачестве донора для BRET (такие системы получили название BRET3 [157]) былиопубликованы в 2002 году [55]. Это было связано с появлением красных флуоресцентныхбелков (λex = 558 и λmaxem=583 нм), спектральные характеристики которых, позволялинаблюдать BRET для люцифераз светляков [158].

Для анализа межбелковых взаимодействий invivo предпочтительнее использовать флуоресцентные белки в качестве акцепторов из-завозможности получения их гибридных белков с одним из участников изучаемоговзаимодействия. Так, первый гибридный белок для BRET-системы на основе люциферазысветляков был получен Arai с соавторами [55] и представлял гибридный белок люциферазаглутатион-S-трансфераза, в качестве акцептора использовали гибридный белок красногофлуоресцентного белка с белком G.

Спектральные характеристики донора и акцепторапредставлены на Рис. 9.Рис. 9. Спектры биолюминесценции для люциферазы светляков Photinus pyralis, спектрыпоглощения и эмисси для красного флуоресцентного белка (DsREd) [55]42Достичь существенной чувствительности с использованием данной BRET-системы неудалось из-за высокого фонового сигнала, обусловленного недостаточным разрешениемспектров биолюминесценции люциферазы и эмиссии красного флуоресцентного белка инебольшого значения BRET-сигнала на этом фоне. Данный метод требовал значительногоусовершенствования, которое осуществил Бранчини с соавторами только в 2011 году,предложив метод с последовательным резонансным переносом энергии, который будет описанниже [159].Другим семейством акцепторов для люциферазы светляков являются красители,отличающиеся по спектральным характеристикам, коэффициенту экстинкции, квантовомувыходу и возможности их модификации функциональными группами.

Для эффективнойрегистрациимаксимальнымBRETакцепторинтеграломдолженобладатьперекрывания спектравысокимкоэффициентпоглощениякрасителяэкстинкции,иэмиссиилюциферазы, а так же растворимостью в реакционной среде, пригодной для конъюгации соспецифической молекулой и возможностью биоконъюгации.В качестве акцепторов могут быть использованы кумариновые и родаминовые красители, однако их коэффициенты экстинкции, как правило, невысоки (ε = 20000-60000 М-1см-1),а также цианиновые красители, обладающие более высоким коэффициентом экстинкции (ε =150000-250000 М-1 см-1). В частности, красители Alexa fluor, которые являются производнымиперечисленных красителей, содержащими сульфогруппу и отличаются более высокимквантовым выходом, стабильностью и растворимостью в воде [160].Несмотря на большое разнообразие доступных красителей, известны лишь единичныеработы с их использованием в качестве акцептора для BRET.

Одной из возможных причинявляется необходимость их химической конъюгации с одним из участников изучаемоговзаимодействия, которая имеет свои ограничения, такие как неоднородность составаполученных конъюгатов и в некоторых случаях частичная потеря специфической активности.Так японскими учеными [161] для конкурентного анализа myc пептида была получена парадонор/акцептор: гибридный белок глутатион-S трансфераза-антиген (myc пептид)-люциферазасветляков, выступающий в качестве донора и антитела меченые цианиновыми красителями(акцептор). В данной работе были использованы цианиновые красители с различнымиинтегралами перекрывания спектров поглощения красителей со спектром биолюминесценциилюциферазы светляков (λmax em = 550 нм): Cy3 (λmax em = 570 нм), Cy3.5 (λmax em = 596 нм), Cy5(λmaxem= 672 нм).

Было проанализировано влияние взаимного перекрывания спектровбиолюминесценции донора и поглощения/испускания акцептора на чувствительность анализа.Для калибровочных кривых с использованием красителя Cy3 был характерен узкийдинамический диапазон и высокий фоновый сигнал. Для Cy5 наблюдалось только тушение43биолюминесценции без изменения формы спектра. Краситель Cy3.5 оказался оптимальным,поскольку наблюдался меньший фоновый сигнал и более широкий динамический диапазонизменения BRET-сигнала по сравнению с красителем Cy3. При изменении BRET- сигнала,рассчитанного как соотношение интенсивностей излучения при 596 нм к 550 нм (I596/I550), от 0,2до 0,8, диапазон измеряемых концентраций составил 0,2 - 2 мкМ.Системы на основе BRET с использованием люциферазы светляков можно разделить надва типа.Первый тип - межмолекулярный BRET (классический вариант), где расстояние междудонором и акцептором изменяется под действием изучаемых факторов: а) донор и акцепторнаходятся в составе двух разных молекул, которые под действиемизучаемого фактораассоциируют [55] или диссоциируют; б) донор и акцептор, находятся в составе одноймолекулы,но разделенырасщепляемым линкером,либоучастком, отвечающим законформационные изменения [162].

Такой вариант используется для анализа межмолекулярныхвзаимодействий.Второй тип - внутримолекулярный BRET, примером которого служит перенос энергиивозбужденного состояния люминофора (продукта люциферазной реакции) на молекулукрасителя или флуоресцентного белка, ковалентно иммобилизованного на поверхностилюциферазы, в результате чего происходит сдвиг спектра биолюминесценции в областьбольших длин волн.

Последний подход находит применение при фундаментальныхисследованиях различных факторов, влияющих на BRET, для создания высокоэффективныхреагентов для имиджинга в условиях in vivo, поскольку, как уже было сказано, красный светобладает большей проникающей способностью по сравнению с зеленым [163].Конъюгаты люцифераза-краситель были получены для люцифераз Cypridina [163] и длямутантнойтермостабильнойформылюциферазыP.ppyralis[69],атакжедлябиотинилированных гибридных белков на их основе.Так для люциферазы Cypridina реакцию конъюгации проводили по OH-группам(гликолевые цепочки люциферазы), с активацией перйодатом и последующим использованиеминдоцианового производного красителя HiLyte Fluor™ 647-гидразид.

В результате был полученконъюгат состава 1:2 (люцифераза:краситель), для которого наблюдался бимодальный спектр,не зависящий от физиологических условий, с двумя максимумами испускания при 460 нм, 675нм, соответствующими биолюминесценции люциферазы и флуоресценции красителя, однакоэффективность переноса BRET-переноса была невысокой: интенсивность испускания красителяпри λmax em = 675 нм составляла 30% от интенсивности испускания люциферазы λmax em = 460 нм[163].44В работе [69] для люциферазы P. pyralis была значительно улучшена эффективностьпереноса, изучено влияние расстояния, ориентации диполей и квантового выхода красителя наэффективность внутримолекулярного BRET.

Для этого были получены мутантные формыфермента, содержащие на поверхности один и два остатка цистеина, по которым проводиликонъюгацию с красителями Alexa Fluor® nIR dyes AF, содержащими малеимидную группу.Было показано, что при сближении красителя с активным центром люциферазы всего на 15анкстрем (мутанты с одним цистеином в положении 399 или 169) эффективность BRETвозрастала в 5-9 раз до 1:4.

При введении обоих цистеинов T169C и S399C соотношение Iλmax emLuc/ Iλmax em Dyeувеличилось до 1:34, что в 8,5 раз эффективнее, чем для квантовых точек (1:4) [69].Другой фактор, влияющий на эффективность переноса – это ориентация диполей красителей иквантовый выход их флуоресценции. Так, для AF680с квантовым выходом 0.36,эффективность BRET была в 8,5 раз больше по сравнению с AF750 , для которого квантовыйвыход в 3 раза меньше.

Конъюгат с красителем AF680 был получен и для гибридного белкалюциферазы P. pyralis (T169C, S399C) с биотинилированным биотинсвязывающим доменом,содержащим 12-аминокислотный линкер, расщепляемый протеазами, позволяющий измерятьактивность фактораXa в крови в физиологических концентрациях. Для окрашенногогибридного белка эффективность BRET (IλmaxemLuc/IλmaxemDye)составила 1:14, однакобиолюминесцентная активность снизилась до 70% от активности того же окрашенногофермента без домена.Последовательный резонансный перенос энергии на основе люциферазы светляков.Как уже упоминалось выше, использование люциферазы светляков в качестве донора икрасногофлуоресцентногобелкавкачествеакцепторазатрудненоиз-завысокогобиолюминесцентного сигнала при длине волны испускания акцептора.

Способ улучшенияразрешения максимумов биолюминесценции и эмиссии акцептора впервые был предложенБранчини с соавторами [159] и был назван последовательный резонансный перенос энергии(SRET), сочетающий в себе две последовательных стадии переноса- BRET, затем FRET (Рис.10).СутьметодасводиласькмодификацииакцепторавпареBRET(красногофлуоресцентного белка mKate S158A, λex = 585, λmax em = 625) красителем (Alexa Fluor 680, λex =680, λmaxem= 705). При этом добавлялась дополнительная стадия FRET-переносавозбужденного состояния красного флуоресцентного белка на краситель, после чегорегистрировалось испускание от красителя (λmax em Luc =560, λmax em Dye = 705 нм), спектр эмиссиикоторого был существенно смещен в красную область и не перекрывался со спектромбиолюминесценции люциферазы (Рис.

10). Таким образом, наблюдалось практически полноеразрешение пиков эмиссии донора и акцептора. Стоит отметить высокую эффективность FRET,45(практически полное отсутствие эмиссии красного флуоресцентного белка), обусловленнуюминимальным расстоянием между флуоресцентным белком и ковалентно связанным с нимкрасителем.При введении специфических сайтов узнавания протеаз между донором и акцепторомBRET, были получены высокочувствительные сенсоры для детекции активности протеаз и ихколичественного определения. Пределы детекции составили 0,41 нМ для каспазы-3, 1 нМ длятромбина, 58 нМ для фактора Xa [159].Рис. 10. Схема переноса энергии и спектр испускания, полученный для данной схемы.