Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений), страница 8

Центральная длина волны 780 нм, длина сканов – около 18 пс,спектральный диапазон 0.15 – 4 ТГц, центральная частота в терагерцовом спектре 1 ТГц,отношение сигнал/шум составляет 3 порядка. Установка позволяет проводить измеренияобразцов со значениями оптической плотности до 3 единиц.1.3.

Спектроскопия комбинационного рассеяния29Эксперименты с применением метода спектроскопии комбинационного рассеяния светапроводились на КР-микроскопе DXR Raman Microscope (Thermo Scientific) – далее по тексту«установка 5» (Рис. 4).Рис. 4. КР микроскоп DXR Raman Microscope (Thermo Scientific).Спектральный диапазон этого прибора от 50 до 3550 см-1. Микроскоп позволяетпроводить измерения на трех различных длинах волн возбуждения – 532, 633 и 780 нм.Источниками возбуждения являются твердотельный Nd:YAG лазер с диодной накачкойна длине волны 532 нм, при этом максимальная мощность на образце составляет 10 мВт, HeNe лазер на длине волны 632,8 нм, максимальная мощность которого составляет 8 мВт, атакже диодный одномодовый лазер со стабилизацией частоты на длине волны 780 нм имаксимальной мощностью 24 мВт.Микроскоп оснащен пятью сменными объективами с увеличением 4х (цифроваяапертура 0,1), 10х (цифровая апертура 0,25), 20х (цифровая апертура 0,4), 50х (цифроваяапертура 0,75), 50х длиннофокусный (цифровая апертура 0,5; рабочее расстояние 10,6 мм) и100х (цифровая апертура 0,9).

Изображение объекта записывается цветной цифровойвидеокамерой с матрицей 1024×768 пикселей. Предусмотрена возможность наблюденияобъекта в поляризованном свете. Спектральное изображение записывается ПЗС детектором сматрицей 1024×128 пикселей. Микроскоп имеет 2 круглые апертуры, обеспечивающиеконфокальный режим, и 2 щелевые апертуры, обеспечивающие возможность регистрироватьслабые сигналы за счет потери конфокальности.

Спектральное разрешение зависит отиспользуемого объектива и апертуры и изменяется в диапазоне от 1 до 8 см-1,пространственное разрешение – до 1 мкм.Прибор также позволяет усреднять спектры по нескольким измерениям, с ручнымконтролем времени экспозиции и времени измерения.30§ 2. Методы обработки данныхОдной из важных задач анализа экспериментальных данных является задача сравненияспектров. Например, это необходимо при анализе содержания элементов вторичной структурыобразцов, составов исследуемых объектов, проверке воспроизводимости спектральныхданных, сравнении экспериментальных данных.

Однако непосредственное сравнение спектровналожением друг на друга часто осложняется наличием в них фоновых составляющих. В связис этим возникает необходимость применять различные методы, позволяющие упроститьанализ экспериментальных результатов и, при этом, вносящие минимум изменений вспектральные линии.2.1ПервичнаяобработкаэкспериментальныхданныхИК-Фурье,ТГциКРспектроскопииОбработка полученных данных по ИК-Фурье и КР спектроскопии значительноупрощается, так как к ним применимо стандартное программное обеспечение Omnic [91],позволяющее преобразовывать данные в нужные форматы. Таким образом, результатомизмерений являются спектры поглощения и рассеяния образцов. Для удобства анализаисходные данные сглаживаются при помощи фильтра Савицкого – Голлея [92].Для ТГц спектрометра стандартного программного обеспечения не существует,поэтому была использована следующая методика.

В экспериментах регистрируетсявременной профиль терагерцового импульсного излучения (ТГИ), который проходит черезисследуемый образец. Применяя преобразование Фурье, можно вычислить комплексныйспектр, содержащий информацию о показателях преломления и поглощения среды, черезкоторую прошел импульс. Для вычисления оптических свойств образца проводитсяреконструкция оптических параметров по измеренным спектрам пропускания [93].

Совершивпреобразование Фурье двух временных профилей ТГИ – импульса, прошедшего через образеци импульса, прошедшего через пустую рамку держателя образца (опорный сигнал) – можнополучить амплитуду поля прошедшего через образец Eобр(ω) и амплитуду поля Eоп (ω)опорного сигнала. Отношение этих амплитуд дает спектральный коэффициент пропусканияобразца.Используяматематическиепреобразования,коэффициента поглощения образца.2.2. Метод сравнения31можнополучитьизначениеОдним из применяемых в работе для сравнения спектров методов является следующийматематический алгоритм, позволяющий сравнивать между собой как два различных спектра,так и один спектр с суперпозицией нескольких без предварительного вычитания фона [94].

Вработе этот метод применялся для сравнения спектров двух различных белков, а также длясравнения спектров образцов, представляющих собой смесь нескольких веществ, со спектрамикомпонент смеси.Спектр произвольного образца можно представить в виде суммы полезного сигнала ифона. Если в результате эксперимента измерены спектры n произвольных образцов  i ( x q )(i=1,…, n), то можно записать равенство i ( x q )  f i ( x q )   i ( x q ), i  1,...n ,где f i ( x q ) и  i ( x q ) – полезные сигналы и фоны соответственно, x q – абсцисса спектральнойточки с порядковым номером q = 1,…,N.Если рассматривать спектр модельного образца  ( x q ) , содержащего только тевещества, которые определяют спектры  i ( x q ) , то его тоже можно представить в видесуперпозиции полезного сигнала и фона  ( x q )  f ( x q )   ( x q )nПри этом f ( x q )   k i f i ( x q ) .

Таким образом можно записатьi 1nn ( x q )   k i  i ( x q )   ( x q ) , где  ( x q )   ( x q )   k i i ( x q )i 1i 1Функция ( x q ) может быть задана полиномом конечной степени, так как фон большинствавеществ является медленно меняющейся функцией. Следовательно, последнее математическоеnPвыражение может быть записано в виде  ( xq )   kii ( xq )   a j xqji 1j 0Таким образом, любой спектр можно аппроксимировать суммой спектров компонент,помноженных на весовые коэффициенты ki. Используя результаты разложения, мы можемсудить о наличии каких-либо изменений в образце в результате того или иноговзаимодействия (Рис. 5).32Рис. 5. Интерфейс программы сравнения (верхняя панель) и представление результатов в программеOrigin (нижняя панель): исходный спектр (1), результат аппроксимации (2), аппроксимирующаякомпонента (3), и полином (4).Функционал программы позволяет менять степень полинома, моделирующего фоновыйсигнал и выбирать несколько диапазонов, по которым будет проводиться сравнение.

Эторасширяет возможности пользователя в соотнесении изменений и анализе сходств в спектрахобразцов. На рисунке представлен пример работы программы.332.3. Метод катящегося колесаДля удобного анализа данных применялась программа вычитания фона, методикакоторой предложена в работе [95] и основана на геометрических различиях фона и полезногосигнала на построенном определенным образом графике.График представляет собой массив экспериментальных данных и рассматривается какобычная геометрическая фигура – плоская кривая.

В этом случае исходный массив данных –это массив координат точек (Xi, Yi) плоской кривой. Для каждой i-й точки исходного массивастроится окружность некоторого радиуса так, чтобы выполнялись следующие условия: 1) Xкоордината центра окружности должна совпадать с X-координатой i-й точки исходной кривой;2) исходная кривая и строящаяся окружность должны иметь хотя бы одну общую точку; 3) Yкоординаты всех остальных точек строящейся окружности должны иметь меньшее значениепо сравнению с Y-координатой точек исходной кривой с такими же значениями X-координат(то есть окружность должна находиться полностью под графиком).В начале процедуры выходной массив данных совпадает с исходным. В процессепостроения окружностей для каждой i-й точки выходной массив редактируется.

На каждомшаге вычисляется разница между Y-координатой исходного массива данных и Y-координатойверхней точки построенной на этом шаге окружности. Получившееся значение сравнивается сY-координатой точки исходного массива данных с таким же значением X. В выходной массивзаписывается наименьшее из этих двух значений Y. Таким образом, после прохода по всемточкам исходного графика, на выходе получается массив координат точек для новой плоскойкривой – результата вычитания фоновой компоненты.(а)(б)Рис. 6. Схематическое представление принципа работы программы сравнения (а) и интерфейс программы (б).34Метод схематически можно представить как качение окружности постоянного радиусапод спектром (Рис.