Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений), страница 6

В одной из первых работ по применению КР спектроскопии спектр кристаллическоголизоцима был сравнен со спектром этого белка в растворе [81]. Были выявлены линии начастотах 25, 75, 115, и 160 см-1 в спектре кристаллического образца. В спектре раствора самая20низкочастотная линия на 25 см-1 отсутствует. Эту линию и линию на 75 см-1 авторы работыприписывают внутримолекулярным и торсионным колебаниям, соответственно.Таким образом, методы ИК и КР спектроскопии в исследовании биологическихобъектов и их структуры применяются уже очень давно.

Большое количество работ по этойтеме привело к созданию объемной библиотеки данных по соотнесению спектральных линийи типов колебаний. В диапазоне «отпечатков пальцев» (500 – 1800 см-1) ИК спектровнаходитсябольшоеколичествоопределенного органическоголинийпоглощения,соединения. Это,индивидуальныхв основном,дляобластькаждоговалентных идеформационных колебаний. По наличию или отсутствию конкретных линий в спектре в этомдиапазоне можно определить само исследуемое вещество. Средний диапазон КР спектровтакже хорошо изучен и существуют табличные значения частот колебаний различныхаминокислот и связей, основываясь на которых можно сделать предположения о структуре исоставе исследуемого объекта. В таблице ниже представлены основные приписки линий ИК иКР спектров белков и аминокислот.Таблица 2.

Основные линии ИК и КР спектров белков и некоторых аминокислот.Частота, см-1200Линии ИК спектраЧастота, см-1Скелетные торсионные200колебания (Амид VII)Внеплоскостные С=О537 – 606Линии КР спектраСкелетные торсионныеколебания (Амид VII)Внеплоскостные С=Оизгибные колебания (Амид540 – 600VI)изгибные колебания (АмидVI)Внеплоскостные N=H550 – 700изгибные колебания (Амид545Триптофан625ФенилаланинV)625 – 7671012 – 1016O-C-N изгибные колебания(Амид IV)триптофан625 – 770O-C-N изгибные колебания(Амид IV)Внеплоскостные N=H1064триптофан640 – 800изгибные колебания (АмидV)1092триптофан646тирозин1203триптофан760триптофан836тирозин1230 – 1300С-N валентные и N-Hизгибные колебания (Амид21III)1245триптофан860тирозин1270тирозин1006фенилаланин1334 – 1342триптофан1014триптофан1462триптофан1035фенилаланин1450фенилаланин1180тирозинС-N валентные и N-H1500 – 1575изгибные колебания (АмидС-N валентные и N-H1230 – 1300II)1555тирозинизгибные колебания (АмидIII)1340триптофанС-N валентные и N-H1585фенилаланин1480 – 1580изгибные колебания (АмидII)1600 – 1700Валентные С=О колебания(Амид I)1553триптофантриптофан1605фенилаланин15801610тирозин1600 – 169031003300N=H валентные колебания(Амид B)N=H валентные колебания(Амид А)162231003500Валентные С=О колебания(Амид I)триптофанN=H валентные колебания(Амид B)N=H валентные колебания(Амид А)Также известно, что в низкочастотном диапазоне спектра лежат линии колебанийводородных связей таких молекул, как ДНК [82,83], проявляющихся в результате движениямолекул друг относительно друга.§3.

Изучение влияния денатурации и ингибирования на функционированиебелков методами спектроскопииКак уже упоминалось выше, функционирование белков зависит от их структурнойорганизации и от состояния активного центра молекулы. На его свойства, в свою очередь,могут влиять различные факторы, например температура или взаимодействие с реагентами,приводя к денатурации белка. Большинство белков может быть легко денатурировано путемнагрева, который влияет на слабые взаимодействия в молекуле белка, например, на22водородные связи.

Взаимодействие с такими реагентами денатурации, как органическиерастворители,мочевина,моющиесредства(детергенты)приводиткразрушениюгидрофобного поверхностного слоя глобулярного белка. Изменение естественного дляфункционирования белка значения pH до экстремальных значений приводит к изменениюсуммарного заряда белка, следовательно, к кулоновскому электростатическому отталкиваниюи разрушению водородных связей. Также взаимодействие со специфическими молекулами,встраивающимися в активный центр белка и блокирующими его работу, может приводить кего ингибированию, то есть прекращению функционирования.

Результатом такого измененияусловий окружающей среды является изменение вторичной структуры молекул белков.Существуют работы, в которых проводится анализ спектральных данных белков при такихвзаимодействиях.Так, в работе [84] проводится анализ структуры белка рибонуклеазы в термическиденатурированном состоянии. Согласно данным различных методик термическая денатурациярибонуклеазы не приводит к полной потере вторичной структуры белка. Например, анализданных, полученных методом кругового дихроизма позволил сделать предположение о том,что при термической денатурации рибонуклеазы сохраняется до 50% содержания αспиральных элементов вторичной структуры относительно того количества, котороенаблюдается в нативной структуре молекулы белка. С другой стороны, метод спектроскопииЯМРпоказывает,чтоскоростьобменапротонамивамиднойцепитермическиденатурированного белка близка к показателям полностью неупорядоченного полипептида.Для разрешения такого несоответствия авторы работы применяют метод ИК спектроскопиидля сравнения структуры термически денатурированной рибонуклеазы со структурой,образующейся в результате химической денатурации белка.

Линия амид I ИК спектранативной рибонуклеазы состоит из нескольких линий, с хорошо различимыми пикамикомпонент на частотах 1633 см-1, 1651 см-1, 1663 см-1 и 1680 см-1. Эти линии могут бытьсоотнесены с характерными элементами вторичной структуры белка – α- и β-структурами. Притермической денатурации линия амид I белка превращается в не имеющую резко выраженныхособенностей широкую линию с пиком на частоте 1649 см-1. Таким образом, происходитзначительное перераспределение интенсивностей и положений линий при термическойденатурации. Более того, высокоинтенсивная линия на частоте 1633 см-1, присутствовавшая вспектре нативного белка, фактически исчезает при его нагревании.

Учитывая, что эта линияможет быть соотнесена с содержанием доминирующих элементов вторичной структурырибонуклеазы – β-листов, можно сделать заключение об отсутствии этих элементов втермически денатурированном образце, то есть о значительном изменении структурымолекулы. Аналогичные результаты получаются при химической денатурации рибонуклеазы –23линия амид I ИК спектра денатуированного мочевиной белка почти полностью совпадает слинией термически денатурированного белка.В работе [85] наряду с другими применяется метод КР спектроскопии для изучениявлияния структуры белка на реакционную способность дисульфидных связей привзаимодействии с химическим агентом трис(2-карбоксэтил)фосфин (ТКЭФ), которыйкатализирует разрыв дисульфидных мостиков.

Известно, что дисульфидные мостики являютсяважными составляющими структуры молекулы. Дисульфдные связи ограничивают возможноеконфигурационное пространство белка, что позволяет стабилизировать определеннуюконформацию молекулы белка. Разрыв всех или части дисульфидных мостиков приводит кразворачиванию молекулы, то есть к частичной или, возможно, полной денатурации белка.Авторы работы на примере взаимодействия белка лизоцима, обладающего четырьмядисульфидными связями, и агента разрыва этих связей ТКЭФ исследуют влияние исходнойструктуры молекулы на способность связей разрываться. Методом КР спектроскопии былиполучены спектры нативного лизоцима и лизоцима, провзаимодействовавшего с ТКЭФ вдиапазоне частот колебаний дисульфидных связей – 500 – 550 см-1. Спектр былаппроксимирован набором лоренцевых компонент, среди которых три линии (509, 528 и 545см-1) соответствовали гош-гош-гош, транс-гош-гош и транс-гош-транс конформациямдисульфидных связей.

Анализ изменений параметров этих лоренцевых компонент, а такжеизменений в чувствительной к вторичной структуре линии спектра амид I, происходящих приувеличении процентного содержания ТКЭФ в смеси с белком позволил сделать выводы остепени разрушения исходной вторичной структуры молекулы лизоцима.Аналогичный подход применялся авторами в работе [86]. Исследовалась структурабелкабычьегосывороточногоальбуминапривзаимодействиисагентомразрывадисульфидных связей дитиотреитолом (ДТТ). На основании полученных результатов былисделаны выводы о стабильности структуры белка при таком взаимодействии.Методом КАРС спектроскопии исследована вторичная структура химотрипсинанативного и лигандированного антраниловой кислотой [87].

Полученный в результатеизмерений раствора химотрипсина в тяжелой воде спектр был аппроксимированы наборомнескольких компонент в диапазоне линии амид I. Спектр лигандированного белка былаппроксимирован исходно тем же набором компонент с возможностью варьировать параметрыкомпонент. Результаты аппроксимации для нативного и провзаимодействовавшего сантраниловой кислотой белка отличаются как по положению линий, так и по их амплитуде. Впредположении, что использованные компоненты аппроксимации соответствуют тремосновным элементам вторичной структуры белка, авторы смогли сделать вывод о том, что24лигандирование белка приводит к значительному уменьшению содержания β-структурныхкомпонент и к увеличению α-спиральности молекулы белка.Метод резонансной КР спектроскопии применяется авторами [88] для изучениявзаимодействия между ингибитором и белком бычьим трипсином.

Получены спектрынативного и провзаимодействовавшего с трипсином ингибитора. Наиболее заметныеизменения проявляются в интенсивностях линий на частотах 1171 см-1, 1206 см-1, 1315 см-1 и1608 см-1. Также отмечена тенденция к сужению линий ингибитора при взаимодействии сбелком. Сравнение спектра ингибитора со спектрами соединений, представляющих собой егочасти, а также анализ литературных данных позволил провести отнесение спектральных линийк колебаниям различных функциональных групп.Заключение к главе 1Белки являются одними из важнейших биологических объектов. Это сложныемолекулы, имеющие четырехуровневую структурную иерархию.