Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений)

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВАФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиМанькова Анна АлександровнаНИЗКОЧАСТОТНЫЕ КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ СПЕКТРЫ МОЛЕКУЛБЕЛКОВ КАК ХАРАКТЕРИСТИКИ ИХ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙСпециальность` 03.01.02 – биофизика, 03.01.08 – биоинженерияДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степеникандидата физико-математических наукНаучный руководитель:доктор физико-математических наук,профессор Чикишев А.Ю.Москва, 2017г.СодержаниеОглавлениеВведение ..........................................................................................................................................

4Цели и задачи диссертационной работы .............................................................................................. 8Научная новизна.................................................................................................................................... 9Теоретическая и практическая значимость .......................................................................................... 9Структура и объем диссертации ...........................................................................................................

9Глава 1 Применение методов колебательной спектроскопии в изучении молекул белков и ихструктурных изменений, происходящих при различных воздействиях. .................................... 10§1. Строение молекул белков и особенности функционирования водорастворимых белков вневодных средах .....................................................................................................................................

10§2. Методы колебательной спектроскопии в изучении структуры белков в диапазоне 50-1800 см-1 .. 15§3. Изучение влияния денатурации и ингибирования на функционирование белков методамиспектроскопии ......................................................................................................................................... 22Заключение к главе 1 .............................................................................................................................. 25Глава 2 Методы измерений и обработка экспериментальных данных .......................................

26§ 1. Описание экспериментальных установок ....................................................................................... 261.1. ИК-Фурье спектроскопия ............................................................................................................. 261.2. Терагерцовая спектроскопия........................................................................................................ 291.3. Спектроскопия комбинационного рассеяния .............................................................................. 29§ 2.

Методы обработки данных .............................................................................................................. 312.1 Первичная обработка экспериментальных данных ИК-Фурье, ТГц и КР спектроскопии.......... 312.2. Метод сравнения .......................................................................................................................... 312.3. Метод катящегося колеса .............................................................................................................

342.4. Итерационный полиномиальный метод вычитания фона ........................................................... 352.5. R(ν) представление спектров ....................................................................................................... 362.6 Аппроксимация линий спектра ..................................................................................................... 37Глава 3 Низкочастотная колебательная спектроскопия в исследовании взаимодействиямолекул белка с краун-эфиром .....................................................................................................

37§ 1. Низкочастотная ИК-Фурье и ТГц спектроскопия комплексов трис-краун .................................... 371.1. Способы приготовления образцов ............................................................................................... 391.2. Анализ зависимости низкочастотных ИК-Фурье и ТГц спектров триса от концентрации краунэфира....................................................................................................................................................

40§ 2. Низкочастотная ИК-Фурье и ТГц спектроскопия системы белок-краун ....................................... 49Заключение к главе 3 .............................................................................................................................. 552Глава 4 Низкочастотная ИК-Фурье и КР спектроскопия белков с различным содержаниемэлементов вторичной структуры .................................................................................................. 57§1. Экспериментальные образцы............................................................................................................

59§2. Контрольные измерения в диапазоне «отпечатков пальцев» .......................................................... 61§3. Сравнительный анализ низкочастотных колебательных спектров нескольких белков .................. 63Заключение к главе 4 .............................................................................................................................. 72Глава 5 Применение методов низкочастотной колебательной спектроскопии для анализавлияния денатурации и ингибирования на структуру белка .......................................................

73§ 1. Экспериментальные образцы........................................................................................................... 73§ 2. Сравнительный анализ низкочастотных колебательных спектров нативных и модифицированныхбелков ......................................................................................................................................................

74Заключение к главе 5 .............................................................................................................................. 85Заключение .................................................................................................................................... 87Основные результаты и выводы............................................................................................................. 87Положения, выносимые на защиту ........................................................................................................ 88Благодарности ............................................................................................................................... 89Список литературы........................................................................................................................

893ВведениеВ современном развивающемся мире существует множество прикладных задач,находящихся на стыке нескольких наук – физики, химии, биологии и медицины. Эти задачипозволяют расширять границы познания различных жизненных процессов, и направлены наулучшение качества жизни человека. Одной из таких задач является изучение биологическихобъектов – их свойств, функций и способов регуляции их работы.

Важнейшими объектамитакого рода являются белки, принимающие участие во всех процессах жизнедеятельности.Например,белки–ферментыкатализируютвсехимические,электрохимическиеимеханохимические процессы в клетках и в организмах. Существуют специализированныеферменты, которые служат катализаторами всех метаболических реакций, а также являются ирегуляторами генетических функций нуклеиновых кислот.

Можно сказать, что белки являютсяобязательными участниками запасания, передачи, трансформации и рецепции химическихсигналов в живых системах [1].Наряду с участием в процессах жизнедеятельности организмов белки играют важнуюпрактическую роль и в современных биотехнологиях – химический синтез новых веществ,создание, транспортировка и хранение медицинских препаратов – во всех этих процессахважную роль играют именно белковые молекулы. Во всех перечисленных отрасляхопределяющими являются свойства ферментов, их структура, функции и уровень активности,которые и позволяют достигать сформулированных целей в биотехнологических задачах.Применение методов лиофильной сушки облегчает процесс транспортировки препаратов,увеличивает срок хранения образцов.

Лиофилизованные образцы могут применяться впроизводстве белковых молекул для диагностических, терапевтических, косметических целей,а также для создания биологических материалов с применением технологий трехмернойпечати (3D printing).Исследования, проводимые в рамках нового актуального направления – неводнойэнзимологиипоказали,чтозаменанативногоокруженияводорастворимогобелкаорганическими растворителями может привести к изменениям в его функциях. Так, например,водорастворимый фермент химотрипсин, катализирующий гидролиз пептидных связей в воде,запускает другой процесс и – переэтерификацию при попадании в органический растворитель.Недостатком функционирования в органических растворителях является существенноеснижение каталитической активности ферментов. В исследованиях модельной реакциипереэтерификации при участии химотрипсина показано, что добавление молекул краун-эфира,4позволяет на несколько порядков увеличить скорость каталитической реакции в органическомрастворителе.Большой интерес к изучению молекул белков, их функционирования и свойств привелк появлению еще в 60-е – 70-е годы XX века понятия «молекулярные машины» и новойконцепции «белок-машина».

В работах [2,3,4] было сформулировано представление офункционировании белков-ферментов. Суть концепции состоит в том, что молекулу белкаможно представить как своего рода машину (механическую конструкцию, состоящую изотдельных частей, обладающих разной подвижностью и упругостью), работа которой идет позаранее определенному, запрограммированному плану. Основная функция такой машины –обеспечить преобразование, запасание и транспорт энергии без существенной диссипации.Активный центр принимает участие в проведении каталитического акта, в то время какостальные, более жесткие части молекулы составляют ее основной корпус и ответственны заэнергетику процесса. Преобразование энергии происходит благодаря наличию выделенныхмеханических степеней свободы конструкции.

Согласно этой теории функционированиебелковых молекул связано с движением крупных фрагментов друг относительно друга. Вкачестве таких выделенных частей молекулы могут рассматриваться, например, доменытретичной структуры белка, либо отдельные высокоупорядоченные α- или β-структурныефрагменты вторичной структуры.Основываясь на предположении, что энергия молекулы накапливается в виде упругихдеформаций авторы концепции проводят оценку минимальных размеров корпуса молекулыбелка. Расчет размеров молекулы приводится для случая полностью спирализованноймолекулы и для глобулярной структуры. Размер молекулы можно оценить через суммарнуюдлину спирализованных участков. Оценка дает значения размеров молекулы белка ≈10-7 см.Используя это значение, авторы получили значение частоты собственных колебаний около1010 Гц, то есть, для белков, представляющих собой большие молекулы с массами отнескольких единиц до сотен кДа, имеется оценка частот коллективных колебаний, лежащая вдиапазоне сотых долей терагерц.