Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений), страница 4

Более того, термическая стабильность лиофилизованного белка в органическихрастворителях намного выше, чем в водном растворе. Так, при температуре 100˚С в водномрастворе белок быстро теряет свою активность (уже примерно через 15 минут активностьбелка падает до 50%). Если же белковая пудра помещается в раствор трибутирин-гептанола,12содержащий всего 0,8% воды, его термическая стабильность увеличивается во много раз: втечение часа активность белка остается близкой к 100%. Время, в течение которого белокостается активным в органической среде, зависит от природы раствора.

Сравнение значенийскоростей катализируемой липазами реакции переэтерификации между трибутирином игептанолом при различных температурах показало, что при 100˚С скорость реакции выше нанесколько порядков.Простая замена водной среды не может напрямую запустить ту же самую реакцию,которая предполагалась в естественном для фермента окружении, что связано с изменениямикаталитических свойств ферментов. Добавление специфических нуклеофилов к образцамхимотрипсина в органических растворителях может привести к появлению процессовпереэтерификации, которые подавляются в нативной среде. Также становится болеевероятным процесс синтеза эфиров в органическом растворителе, что является обратнойреакцией по отношению к гидролизу.Авторы работы [36] исследовали реакции синтеза дипептидов, катализируемогохимотрипсином, в двухфазном растворе буфера и этилацетата.

Проведено сравнениеэффективности реакции в водном растворе и в двухфазной среде, исследовано влияниепараметров реакции и условий приготовления образцов на выход продукта реакции. Показано,что эффективность реакции в присутствии органического растворителя намного выше, чем вего отсутствии. Среднее время протекания исследуемой реакции в органическом растворителеи достижения равновесного состояния – 6-7 дней. Одними из важнейших факторов, влияющихна процесс синтеза дипептидов, являются исходные концентрации реагентов и значение pHраствора.В работе [37] были исследованы три различные липазы, которые могут катализироватьреакции в нескольких неводных органических растворителях.

При этом реакции все такжеподчиняются кинетике Михаэлиса-Ментена. Было показано, что наряду с реакциямипереэтерификациилипазытакжемогуткатализироватьидругиепроцессыприфункционировании в гидрофобной среде. Например, порциновая панкреатическая липазаможет также катализировать реакции эстерификации, аминолиза, обмена ацильнымигруппами, тиопереэтерификации и оксимолиза. Причем некоторые из этих процессов могутпротекать только в неводной среде. Например, эстерификация с участием бутириновойкислоты и гептанола в воде идет с коэффициентом превращения менее 0,1%, в то время как врастворе гексана коэффициент превращения превышает 90% даже после двух часов.Несмотря на возможность функционирования в неводном окружении, уровеньактивности в органических растворителях ниже, чем в нативной среде [38]. Авторы [39]провели исследование стабильности α-химотрипсина в органическом растворителе.

Среднее13время, за которое активность белка уменьшается в два раза при комнатной температурезависит от значения pH раствора: максимальное время достигается при значении pH 9 иуменьшается с увеличением pH. Для органического растворителя максимальное время, втечение которого белок остается активным, меньше, чем для водного раствора. Такимобразом, стабильность химотрипсина в водной среде выше, чем в органическом растворителе.Изменение температуры влияет на время, в течение которого сохраняется активностьфермента, тем не менее, он остается менее стабильным в органическом растворителе.Эффективностьфермента сильно зависит также идиметилформамиданадиметилсульфоксидприводитот типа растворителя.кувеличениюЗаменастабильностихимотрипсина на несколько порядков.В качестве решения проблемы уменьшения активности ферментов в неводных средахпредложено и используются несколько методов.

Так, в работах [40,41,42,43] показано, что врезультате взаимодействия с краун эфирами ферментативная активность α-химотрипсина ворганических растворителях (ацетонитриле, циклогексане и т.д.) возрастает на несколькопорядков. Этого достаточно для использования этого фермента как активатора процессовпереэтерификации D,L-аланин и –фенилаланиновых эфиров.

Для объяснения эффектавыдвинуто предположение об образовании комплексов поверхностных аминогрупп смолекулами краун эфира.Известно, что максимальная активация α-химотрипсина в ацетонитриле достигается присоотношении 50 молекул краун-эфира к одной молекуле белка, а в циклогексане присоотношении 250:1 [41]. График зависимости активности химотрипсина в различных средах отсодержания молекул краун-эфира представлен на Рис. 1. Так как влияние эфира 18-краун-6 наактивность фермента в разных средах различно, становится интересным изучение зависимостиструктурных изменений белка от концентрации краун-эфира при различных значениях pH,влияющих на активность фермента в водном растворе.14Рис.

1. Зависимость отношения скоростей реакций, катализируемых -химотрипсином в ( )ацетонитриле и () циклогексане в присутствии и отсутствии молекул крауна-эфира от относительноймолярной концентрации 18-краун-6 [59].Таким образом, неводная энзимология является перспективным направлением,имеющим несколько преимуществ для прикладной биоинженерии и биокатализа.

Так,ферменты проявляют более высокую термостабильность в органических растворителях.Способность ферментов в органических растворителях катализировать новые реакции,зачастую не протекающие в водной среде, расширяет возможности применения ферментов длярешения задач биотехнологий. Необходимым условием развития этого направления наукиявляется нахождение оптимальных условий (pH, органический растворитель, способыполучения мелкодисперсной суспензии белка и др.).§2.

Методы колебательной спектроскопии в изучении структуры белков вдиапазоне 50-1800 см-1В настоящее время существует несколько методов, позволяющих получать детальнуюинформацию о структурных, химических и динамических свойствах белков. Одними изнаиболее перспективных и уже давно успешно применяющихся являются методыколебательной спектроскопии – инфракрасной (ИК) Фурье и спектроскопии комбинационногорассеяния (КР) [44,45,46,47]. Также в последнее время активно развивается и становитсяперспективнымдляизучениябиологическихспектроскопии [48,49].15объектовметодтерагерцовой(ТГц)Эти методы основаны на регистрации колебательных спектров молекул (Рис. 2).

Белкипредставляют собой полипептид и, следовательно, имеют нормальные моды колебанийпептидной цепи, которые и образуют спектр белка. Существует девять основныххарактеристических линий колебательного спектра белка, называемых амидами: амид А, B, I,II,…,VII [50,51,52]. Они чувствительны к изменениям конформации белка. Наиболееинтенсивными, а, следовательно, часто применяющимися для изучения процентногосодержания и вида конформаций (то есть вторичной структуры белка), являются линии амид I,II и III.Рис. 2. Основные линии колебательного ИК-Фурье (а) и КР (б) спектра α-химотрипсина.Также в колебательном спектре молекул присутствуют линии аминокислот и другихфункциональных групп, входящих в состав изучаемого объекта.

Положение линий в спектре,их ширина и интенсивность зависят от состава молекулы, а также от изменений окружающейее среды. Поэтому методы колебательной спектроскопии и являются удобными для изученияструктуры белков. Отметим, что линии амид VI и VII расположены в диапазоне частот около600 и 200 см-1, соответственно, также являются конформационно чувствительными и могут16применяться для исследования структуры белков [53,54,55]. Тем не менее, четких данных оположении линий и соотнесении этих частот с колебаниями характерных функциональныхгрупп на текущий момент нет.Анализ колебательных спектров белков совместно с информацией о структуре молекулпо данным рентгеноструктурного анализа и с данными теоретических расчетов спектровмодельных соединений (преимущественно α-спиральных или β-структурных) дал возможностьнайти корреляции между элементами структуры белка и линиями спектра. В частности,авторы статьи [56] исследовали ИК-Фурье спектры 21 глобулярного белка в диапазоне линииамид I (1600-1700 см-1), раскладывая ее на составляющие.

Предполагалось, что эта линиясостоит из 6-9 компонент. Каждой из компонент был поставлен в соответствие определенныйэлемент вторичной структуры, после чего рассчитывались площади под этими компонентамии определялись процентные соотношения присутствующих элементов структуры. Полученныетаким образом результаты соответствуют данным рентгеноструктурного анализа изучаемых вработе белков. В работе [57] метод КР спектроскопии применялся совместно с методомкругового дихроизма для определения вторичной структуры апамина, а также конформациидисульфидныхмостиковприразличныхзначенияхpHраствора.ПрименениеКРспектроскопии в исследовании белков рассмотрено в монографии [58].Методы ИК-Фурье и КР спектроскопии также являются удобными средствами анализаизменений, происходящих с нативной структурой белка при его помещении в неводную среду.Так, в работе [59] методами КР спектроскопии исследовалось взаимодействие белка αхимотрипсина с органическими растворителями.