Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений), страница 5

Проведен анализ структуры молекул белкапри его помещении в водную среду, и органические растворители ацетонитрил и циклогексан.В этих растворителях α-химотрипсин не растворяется, поэтому была исследована егосуспензия.ПрисравненииКРспектровводногорастворафермента,спектровлиофилизованного белка и его суспензий в ацетонитриле и циклогексане выяснилось, чтоспектры лиофилизованного белка и его суспензий в растворителях близки друг другу, а спектрводного раствора фермента сильно от них отличается. Разложение спектральных линийпоказало, что содержание -спиралей в водном растворе составляет 264%, -структуры –354%,инеупорядоченнойконформации–395%.Аналогичныеданныедлялиофилизованного белка и белка, погруженного в органические растворители составляют174%, 577% и 264%, соответственно.

В результате сделаны выводы, что при лиофилизациисущественно возрастает содержание -структуры за счет уменьшения содержания -спирали инеупорядоченной структуры. Таким образом, для лиофилизованного белка и белка в17окружении ацетонитрила и циклогексана характерно одно и то же конформационноесостояние, отличающееся от его рабочего состояния в водном окружении.В работе [60] было изучено изменение вторичной структуры α-химотрипсина,связанное с инверсией функции методом ИК-Фурье спектроскопии нарушенного полноговнутреннего отражения. Как и в работе [59], были проведены измерения лиофилизованногофермента, его водных растворов и суспензий в ацетонитриле и циклогексане.

В результатеоказалось, что самые значительные структурные изменения происходят с молекулой белка припереходе от водного раствора к лиофилизованному образцу. Происходит уменьшениесодержания α-спиралей и увеличение содержания β-структурных участков. Структурабелковой молекулы, находящейся в окружении молекул органического растворителя близка кструктуре белковой молекулы в порошке. Такие же, но менее выраженные структурныеизменения сопровождают и переход от лиофилизованного образца к суспензии в органическихрастворителях. Следовательно, можно предположить, что с точки зрения функциональнойактивностилиофилизованныйбелокзанимаетпромежуточноесостояниемеждугидролитически активным ферментом и ферментом, выполняющим функцию синтеза.Исследование «инверсии» функции белков, в частности α-химотрипсина при увеличениискорости активации белка в органических растворителях было проведено в работе [59].

Былопоказано, что краун-эфир изменяет структуру белка, связываясь не только с егоповерхностными аминогруппами, но и, по всей видимости, с гидроксильными группамиаминокислотных остатков тирозина.Взаимодействие краун-эфиров с аминами приводит к образованию комплексов [61,62], вкоторыхаминогруппанаходитсявнутримакроцикла,аналогичносоответствующимкомплексам щелочных металлов. При этом предполагается, что комплексообразованиеобусловлено водородными связями аминогруппы и атомов кислорода 18-краун-6.В работе [63] были изучены изменения, происходящие в комплексе трис–18-краун-6 приразличных молярных концентрациях веществ и с различными значениями pH и проведеносравнение спектров комплекса с чистыми веществами при одинаковых pH. В результатеавторы заключили, что при эквимолярной концентрации триса и крауна происходит полноесвязывание молекул крауна с трисом при всех значениях pH (и для протонированных и длянепротонированных молекул).

Был сделан вывод, что непротонированная форма триса необразует комплекс с краун-эфиром в присутствии протонированной формы при любыхконцентрациях крауна. При достаточной концентрации крауна он образует комплекс спротонированной формой триса как в присутствии, так и в отсутствии непротонированнойформы. Из полученных результатов авторы сделали предположение, что 18-краун-6предпочтительнее связывается с протонированными аминогруппами белка.18За долгую историю существования методов ИК и КР спектроскопии получено большоеколичество справочной информации по расположению линий спектра, по методам примененияэтих данных для анализа биологических объектов и способам предсказания структуры[64,65,66,56,67,68,69].

Авторы обзора [70] представили большую библиотеку данных по КРспектрам белков, разделенных на группы по типу структурной организации.Спектроскопия в низких частотах также является источником полезной информации обизучаемомобъекте,таквнизкихчастотахлежатлинии,отвечающиеслабыммежмолекулярным взаимодействиям, которые зачастую определяют условия биохомическихпроцессов. В работе [71] приведены низкочастотные ИК и КР (10 – 400 см-1) спектрынескольких известных аминокислот. Однако, работ по низкочастотной спектроскопии белковзначительно меньше, чем в диапазоне отпечатков пальцев, поэтому информация посоотнесению линий спектра типам колебаний довольно скудная. При появлении методов ИК иКР спектроскопии основными изучаемыми образцами являлись модельные вещества, такиекак N-метилцетамид.

Развитие методов расширило область их применения и позволилопроводить измерения самих белков, что дает более точную информацию о положениях линийспектра. Авторы [72] представляют спектры среднего и дальнего ИК диапазонов Nметилацетамида и поли-L-лизина. Так как водородные связи являются одним из основныхрегуляторов пространственной структуры белка и, следовательно, его функционирования,особое внимание уделяется линиям водородных связей изучаемых модельных соединений.Проводится анализ спектральных изменений, возникающих при изменении параметровокружающей среды – температуры образца и значения pH раствора.Низкочастотные ИК и КР спектры были также представлены в работе, в которой Nметилацетамид, как модель пептидной связи белка, был изучен при нескольких значенияхтемпературы [73].

Линии на частотах 190 и 280 см-1 были приписаны торсионным иплоскостным колебаниям, соответственно. Анализ нескольких систем с водородными связямибыл использован для попытки отнести линию спектра на частоте 100 см-1 к колебаниямводородныхсвязей.ДальнейшийанализнизкочастотныхИКиКРспектровN-метилацетамида, лизоцима и апротинина с применением теоретических моделей подтвердилпредложенные приписки линий [74]. Линия на частоте 290 см-1 оказалась чувствительной кструктуре воды в растворе белка.

Низкочастотный спектральный диапазон также обсуждаетсяв [75, 76]. В работах представлены низкочастотные КР спектры нескольких белков, ипроведено сравнение полученных данных с литературными. Отмечено, что в низкочастотномдиапазоне спектры белков не имеют интенсивных узких линий, а представляют собой плавнуюкривую с широкими линиями на ее фоне. Приведены предложенные в разных работахинтерпретации линий низкочастотного спектра, показано преимущество использования R(ν)19представления для анализа спектров на примере N-метилацетамида.

Отмечены линии спектрана частотах 230, 280, 310 см-1, которые приписываются внутримолекулярным колебаниям.Линия 100 см-1 приписывается межмолекулярным колебаниям. Низкочастотные КР спектрыДНК-пленок и лизоцима были также исследованы в работе [77].Большая работа по измерению терагерцовых спектров биологических объектовпроведена авторами работы [78].

Методика измерений чистых белков в низкочастотном ИКдиапазоне (60 – 490 см-1) предложена в работе [79]. Образец представляет собой тонкиебелковые пленки, образовавшиеся в результате лиофилизации из капли водного раствора, вдостаточной степени механически стабильные для перемещения из кюветы в измерительнуюсхему. Условия эксперимента позволили провести измерения спектров нескольких белков приразличных температурах и влажностях. Полученные спектры анализировались с применениемметода разложения спектров на Лоренцевские компоненты.

В результате анализа полученыданные по соотнесению линий спектра различным типам колебаний. Низкочастотные спектрыбелков также представлены в работе [80]. Авторы исследовали белок β-лактоглобулин вразличных формах: нативный, мономер, димер, белок, подверженный термической обработке,а также белок с различными значениями pH. Показано, что ИК спектр белка в диапазоне 50 –500 см-1 не имеет ярко выраженных спектральных особенностей – узких интенсивных линий.Можно выделить только широкую полосу на частотах 50 – 350 см-1. Изменение значения pH отpH 2 до pH 7 приводит к существенным изменениям в этом спектральном диапазоне. Призначениях pH 7 и pH 4 форма спектра не сильно отличается, а различие в интенсивностиобъясняется расхождениями в концентрациях белков в образцах. Понижение pH до значения 2приводит к уменьшению интенсивности линии на частоте 200 – 300 см-1.

Спектр термическиобработанного β-лактоглобулина при значении pH 2 слабо отличается от спектранеобработанного белка при том же pH, а при pH 7 наблюдаются существенные изменения висследуемом диапазоне. Таким образом, факторы, приводящие к денатурации белка(температура и pH) вызывают спектральные изменения в низкочастотной области спектра βлактоглобулина. Различные сочетания экспериментальных параметров приводят к различнымизменениям в спектре, что может объясняться структурными изменениями белка или егодимеризацией.Быстроразвивающаясяобластьтерагерцовойспектроскопииобусловливаетнеобходимость установления приписок низкочастотных линий спектра, которые могли быбыть использованы для дополнительного описания и определения характеристик структурыбелка.