Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений), страница 11

Поэтому широкую составную линию,появляющуюся в спектре комплекса трис-краун в соотношении 1:1 на частоте 1589 см-1 можноприписать колебанию аминогрупп комплекса. Структура такого изолированного комплексапредставлена на Рис. 16.Основываясь на результатах проведенных экспериментов с модельным соединением,можно сделать вывод, что эффект увеличения активности белка при взаимодействии с краунэфиромобусловленвосновномвзаимодействиемименноспротонированнымиповерхностными аминогруппами белка. В связи с этим были проведены эксперименты подополнительному измерению спектров комплексов протонированного триса с крауном и белкахимотрипсина с крауном двумя методами – ИК-Фурье и ТГц спектроскопии.48§ 2.

Низкочастотная ИК-Фурье и ТГц спектроскопия системы белок-краунЭксперименты по ТГц спектроскопии проводились на установке 3, позволяющейполучать спектры в широком диапазоне. Методики ИК-Фурье и ТГц спектроскопии имеютодинаковоепроисхождение,поэтомудолжныдаватьаналогичныерезультаты.Преимуществом результатов ТГц спектроскопии в данном случае является возможностьполучения абсолютных значений коэффициентов поглощения.Комплексы химотрипсин–краун готовились путем лиофилизации из водных растворов.В связи с тем, что размер молекулы белка намного больше размера молекулы триса, а также всоответствии с известными данными по значениям скоростей реакций химотрипсина ворганическихрастворителяхвприсутствиикраунабылиисследованыкомплексыхимотрипсин–краун с соотношениями 1:50, 1:100 и 1:250 молекул химотрипсина и краунасоответственно.

Образцы для экспериментов по ИК-Фурье спектроскопии готовились попроцедуре, описанной в предыдущем параграфе.На Рис. 17 представлены ТГц и ИК-Фурье спектры протонированного триса, крауна исмесей трис-краун. В спектре чистого крауна отметим линии, на частотах 2.0, 3.2, 4.3, 4.7, 5.6,6.8 и 8.0 ТГц (75, 108, 143, 169, 190, 228 и 266 см-1). На правой колонке также наложенытеоретически рассчитанные положения колебательных частот для чистых веществ. Данныеэксперимента хорошо сочетаются с данными расчетов. В спектре триса можно выделитьлинии на частотах 3.0, 4.1, 5.6, 7.2 и 8.1 ТГц (100, 138, 186, 240 и 275 см-1).

Сравнение спектровсмесей со спектрами чистых образцов в этих экспериментах также приводит к выводу, что привзаимодействии 1:1 триса с крауном происходит комплексообразование, что также былопоказано в работах [100,101,102,103,104,105]. Форма спектра такого комплекса значительноотличается от исходных спектров компонент и не представляет собой суперпозицию спектровчистых веществ.

Также можно отметить, что значения коэффициентов поглощения компонентне дают в сумме значения поглощения смеси. Предположительно, линии триса на 3.0 и 4.1 ТГцуширяются и смещаются в низкочастотную область, также фоновое поглощение ввысокочастотной части спектра увеличивается. Часть линий спектра смеси, а именно 3.4, 4.1,6.4 и 7.5 ТГц (115, 135, 214 и 249 см-1) не наблюдаются в спектрах триса и крауна.49__Рис. 17. ТГц (а-е) и ИК (а’–е’) спектры протонированного триса (а, а’), комплексов трис-краун 1:1 (б, б’), 1:2 (в,в’), 1:5 (г, г’), 1:10 (д, д’) и спектры чистого крауна (е, е’).50Дальнейший анализ показывает, что спектры неэквимолярных смесей (1:2, 1:5 и 1:10)также не могут быть представлены как суммы спектров эквимолярного образца и крауна ссоответствующими весовыми коэффициентами концентрационного соотношения.

Спектрынеэквимолярных смесей практическине имеют линий чистого триса. Увеличениеконцентрации крауна ведет к увеличению интенсивностей линий, соответствующих этомувеществу (3.2, 4.5, 5.6, 6.8 ТГц (108, 150, 190 и 228 см-1)). Также максимальное значениекоэффициента поглощения образца смеси 1:2 составляет около 400 см-1, значительно больше,чем максимум поглощения крауна (около 240 см-1), и больше, чем у эквимолярного образца(330 см-1). А поглощение образца 1:5 даже больше – около 430 см-1. При этом в спектре смеси1:2 отсутствует широкая линия на 250 см-1. В то же время, спектры образцов постепенномодифицируются с увеличением относительной концентрации крауна.

Линии на частотах 3.4 и4.1 ТГц (115 и 135 см-1) в спектре эквимолярного комплекса постепенно становятся всеинтенсивнее с увеличением содержания крауна. Линия на 193 см-1 в спектре смеси 1:5смещается на 186 см-1 в спектре смеси 1:10 и еще дальше на 182 см-1 в спектре крауна.

Все этиизменения указывают на то, что никакие из спектров смесей не могут быть представлены ввиде суперпозиции спектров чистых компонент.Основываясь на описанных выше результатах можно предположить, что образцысмесей триса с крауном представляют собой по крайней мере частично упорядоченныеструктуры с коллективными колебательными модами. Гипотетическая элементарная ячейкаобразца 1:2 (или 1:5) может содержать 1/3 (или 1/6) молекул триса и 2/3 (или 5/6) молекулкрауна.

Даже когда относительная молярная концентрация крауна значительно превышаетсодержание триса, спектр смеси может отличаться от спектра чистого крауна.Последующие эксперименты проводились напрямую с молекулами белка. На Рис. 18представлены ТГц и ИК спектры химотриспина, крауна и комплексов химотрипсин-краун сразличными относительными концентрациями крауна. Как и в проведенных ранееэкспериментах, результаты ТГц спектроскопии находятся в соответствии с результатами ИКспектроскопии.51Рис.

18. ТГц (а-г) и ИК (а’–г’) спектры белка α-химотрипсин (а, а’), комплексов химотрипсин-краун 1:100 (б, б’),1:250 (в, в’) и спектры чистого крауна (г, г’).Общие изменения в спектрах образцов, происходящие при увеличении концентрациикрауна, аналогичны тем изменениям, которые происходят со спектрами образцов вэкспериментах с комплексами протонированный трис-краун. Вследствие этого можнозаключить, что минимальное число возможных центров связывания на поверхности белкаравночислупротонированныхповерхностныхаминогруппбелка.Отметимтакжевозможность связывания с поверхностными OH группами [101,102].

Число центровсвязывания может быть установлено с применением данных рентгеноструктурного анализа изработы [106]. При значении pH <8 число протонированных поверхностных аминогруппхимотрипсина не превышает 20. Общая оценка для поверхности молекулы белка говорит отом, что около 50 молекул крауна могут быть размещены на поверхности белка. Такая оценка52основана исключительно на сопоставлении размеров молекулы крауна и молекулыхимотрипсина. В связи с этим исследуемые в работе образцы содержат избыточное количествомолекул крауна по отношению к числу возможных центров связывания на поверхности белка.Экспериментальные данные показывают, что спектр химотрипсина представляет собойдовольно гладкую кривую со слабо разрешенными линиями колебаний на частотах 131, 154 и234 см-1. Спектр образца 1:100 (белок/краун) значительно отличается от спектра чистого белка,а спектр комплекса 1:250 также отличается от спектра чистого белка, но к тому же оказываетсяочень похожим по форме на спектр чистого крауна.

Тем не менее, можно отметить сильноразличающиесязначениямаксимальныхкоэффициентовпоглощенияобразцовинемонотонные вариации в его значении с увеличением или уменьшением относительнойконцентрации компонент комплексов.Соответствие форм спектров на Рис. 18а, Рис. 18а’ и Рис. 18б, Рис. 18б’, а такженаличие линий, присущих спектру крауна, в спектрах комплексов 1:100 и 1:250 позволяетпредположить, что спектры комплексов химотрипсин-краун могут быть представлены в видесуперпозиции спектров чистых веществ. С учетом этого допущения можно рассчитатьспектры образцов смеси химотрипсин-краун на основании измеренных спектров чистыхвеществ и значениях концентраций этих веществ в смеси. Оптическая плотность для образцовсмеси 1:100 и 1:250 была рассчитана в предположении отсутствия взаимодействия междукомпонентами, то есть в предположении аддитивности оптических плотностей.

А также споправкой на массовые отношения компонент – 28% массовой доли белки и 72 % массовойдоли крауна в образце 1:250 и 49% массы белка и 51% крауна в образце 1:100.Результаты расчетов представлены на Рис. 19. Видно, что спектры комплексов 1:100 и1:250 не могут быть представлены линейной комбинацией спектров компонент с нормировкойна концентрационные значения компонент (пунктирные линии). Сравнение этих результатовпозволяет предположить, что происходит взаимодействие белка и крауна, которое, вероятно,ведет к связыванию крауна. В качестве альтернативного объяснения можно использовать идеюформирования гетерогенной субстанции, в которой молекулы химотрипсина вкраплены вматрицу молекул крауна.Предполагая, что молекула химотрипсина представляет собой шар с радиусом около 20Åb, можно оценить объем, занимаемый белковыми молекулами в образце комплексахимотрипсин-краун, и «свободный» объем, в котором могут располагаться молекулы крауна.Расчет для комплекса 1:100 показывает, что вокруг молекулы белка может поместиться одинслой молекул крауна.