Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений), страница 15

Вспектрах белков наблюдаются отличия в положении линий, поэтому совместный анализнескольких белков дает возможность сделать предположения о соотнесении низкочастотныхлиний спектра определенным элементам структуры.1. В ИК спектре белков присутствует широкая линия в диапазоне 100 – 150 см-1.Низкочастотный пик линии на 100 – 150 см-1 может свидетельствовать о большемсодержании β-структур в белке.2. В диапазоне 200 – 280 см-1 ИК спектра белков присутствует линия на частоте около240 см-1, которая может быть соотнесена с колебаниями β-структурных фрагментов.3. Во всех ИК спектрах белков присутствует линия в диапазоне 280 – 360 см-1.Смещение линии в низкочастотную область указывает на принадлежность белка к αспиральным белкам.4.

Низкочастотная линия КР спектров белков на частоте около 110 см-1 являетсяконформационно чувствительной. Смещение пика линии в низкочастотную областьприсуще β-структурным белкам. В спектрах α-спиральных белков появляется плечона частоте 150 – 160 см-1.5. Показано отсутствие корреляции значительных изменений в низкочастотных КРспектрах белков в диапазоне 200 – 470 см-1 с содержанием элементов вторичнойструктуры белков и/или молекулярным весом. Учитывая также неспецифичностьколебаний этого диапазона по отношению к отдельным аминокислотным остаткам,можно предположить связь присутствующих спектральных изменений с различиямив третичной и (или) четвертичной структурах молекул белков.72Глава 5 Применение методов низкочастотной колебательной спектроскопии дляанализа влияния денатурации и ингибирования на структуру белкаКак уже было отмечено ранее, белкам присуща строгая зависимость структурафункция.

То есть изменение структуры молекулы может привести к изменениям и в егофункционировании. Изменение структуры молекулы возможно провести с использованиемизменений естественной окружающей среды, ведущих к изменению состояния поверхностныхгрупп белка, термической денатурации, а также влияния химических реагентов наструктурные элементы молекулы.Одним из способов, позволяющих определить конформационно-чувствительные линиив спектре белка, а значит, получить информацию об изменениях, происходящих в егоструктурной организации, является метод сравнения спектров нативного белка со спектрамибелка в модифицированном состоянии.Существует ряд химических реагентов, которые специфически взаимодействуют соструктурными элементами белковой глобулы.

Так, например, трис(2-карбоксэтил)фосфин(ТКЭФ) и дитиотреитол (ДТТ) приводят к разрыву дисульфидных связей, что существенновлияет на структуру молекулы, так как именно дисульфидные мостики участвуют в создании иудержании определенной пространственной структуры белка.В работе проведены эксперименты по низкочастотной ИК и КР спектроскопии двухбелков–химотрипсинаиБСА,ихмодифицированныхобразцов–белков,провзаимодействовавших с ТКЭФ и ДТТ, а также ингибированного химотрипсина.§ 1. Экспериментальные образцыВ экспериментах использовался химотрипсин фирмы «Самсон - Мед» и БСА фирмы«MP Biomedicals».

Молекулярные массы белковMБСА=66.5 кД и Mхт=25 кД, а числодисульфидных мостиков 17 и 5, соответственно. БСА является преимущественно αспиральнымбелком,вто время как химотрипсин–β-структурным.Количествонеупорядоченных структур у обоих белков примерно одинаковое. (см. Таблица 4 в главе 4).Для разрыва дисульфидных мостиков использовался дитиотреитол (ДТТ) («Sigma»,CAS 3483-12-3) и трис(2-карбоксиэтил)-фосфин (ТКЭФ) («Thermo Scientific», CAS 51805-45-9)Процедуры создания модифицированных образцов основаны на реакциях, описанных встатьях [137,138]. Образцы представляют собой таблетки порошков, лиофилизованных избуферного раствора белков с реагентами. Исходные растворы готовились так, чтобы молярные73отношения белок-ДТТ и белок-ТКЭФ составляли 1:10, и 1:15, соответственно. Полученныерастворы лиофилизовались.Для ингибирования химотрипсина использовался полиметилсульфонил флюорид(ПМСФ) («Helicon», CAS 329-98-6).

Водный раствор химотрипсина при концентрации 1 мг/млсмешивался с предварительно приготовленным раствором ПМСФ в ацентонитриле, которыйпредотвращает гидролиз ингибитора до смешивания с белком. Молярное соотношениеполучающегося раствора удерживалось на значении химотрипсин-ПМСФ 1:3.

После этогораствор лиофилизовался.ВэкспериментахпоИКспектроскопииисследуемыхобъектовприменяласьконфигурация прибора «на пропускание», вследствие чего аналогично предыдущимэкспериментам для получения механически стабильных таблеток было необходимоприменение матрицы. В качестве матрицы была использована парафиновая пудра ссоотношением белок-парафин в образце примерно 1:5.

Таким образом, получалисьспрессованные под давлением около 20 МПа таблетки массой от 35 до 40 мг, диаметром 13 мми толщиной около 300 мкм. ИК спектр парафина в исследуемом диапазоне не имеетхарактеристических особенностей и представляет собой плавный, медленно меняющийся (от0.1 до 0.2 единиц оптической плотности) низкоинтенсивный сигнал, дающий слабый вклад визмеряемый спектр. При этом спектры белков имеют средние значения оптической плотностипорядка 1.1 – 1.2.§ 2.

Сравнительный анализ низкочастотных колебательных спектров нативных имодифицированных белковЛинии ИК спектров белков в исследуемом диапазоне широкие, слабоинтенсивные,наблюдается перекрытие нескольких соседних линий. В связи с этим необходим наборметодовобработкиипредставленияэкспериментальныхрезультатов,позволяющийсравнивать спектры друг с другом.

Так, любой спектр может быть представлен суперпозициейнескольких компонент. Согласно существующим припискам, в исследуемом диапазоне, до 600см-1, спектр может быть аппроксимирован минимум семью лоренцевыми кривыми. В нашемслучае необходимо было добавлять дополнительные линии, чтобы получить качественныйрезультат. В результате спектры были аппроксимированы суммой 13-ти компонент. На Рис. 30показан пример аппроксимации. Аналогичная процедура была проведена для ИК-Фурьеспектров всех исследуемых образцов.74Рис.

30. Аппроксимация ИК спектра химотрипсина лоренцевыми линиями.Для каждого спектра изначально использовались одинаковые параметры лоренцевыхкривых и допускались лишь небольшие сдвиги в положениях линий для получениякачественной аппроксимации. Такое ограничение позволяет проводить сравнение результатов.На Рис.

31а представлены ИК спектры БСА нативного и его модифицированныхсостояний в диапазоне 100 – 370 см-1. Для удобства проведения сравнения спектры сдвинутыотносительно друг друга по вертикальной оси и поглощение представлено в относительныхединицах.Спектры всех образцов имеют широкую несимметричную линию поглощения винтервале 100 – 200 см-1. Этот диапазон спектра БСА аппроксимируется двумя компонентами.Положения центральных частот лоренцевых кривых для нативного БСА 118 и 168 см-1.Положение первой линии неизменно для других образцов в то время, как положение второйкомпоненты варьируется от 159 до 167 см-1. То есть при денатурировании белка происходитсмещение высокочастотного крыла линии в низкочастотную область, что может обозначатьчастичное разворачивание α-спиралей и образование β-структурных элементов согласноданным главы 4. Это предположение соответствует результатам работ [139,140], в которыхпроведено изучение вторичной структуры денатурированных α-спиральных белков.

Такжеможно отметить различия в ширине и относительных амплитудах второй линии. Согласнолитературным данным линии колебаний в этом диапазоне могут относиться к NH75внеплоскостным изгибным колебаниям, CN торсионным или CO внеплоскостным изгибнымколебаниям.Рис. 31. ИК-Фурье спектры БСА (а) и химотрипсина (б): 1 - комплексы белок-ТКЭФ, 2 – термическиденатурированные белки, 3 - белок-ДТТ, 4 - нативные белки, 5 - ингибированный химотрипсин.Для образцов химотрипсина наблюдаются аналогичные результаты (Рис.

31б). Вспектрах также есть широкая линия в исследуемом диапазоне, которая может бытьаппроксимирована минимум двумя лоренцевыми кривыми. Параметры этой аппроксимациитаковы, что положения компонент для нативного химотрипсина составляют 115 и 148 см-1.Для образца белка, модифицированного ТКЭФ, и термически денатурированного образцаположения этих линий остаются такими же, хотя относительные амплитуды этих компонентвсе же отличаются. В образце с ДТТ происходит смещение положений компонентаппроксимации на 109 и 141 см-1, соответственно. В ингибированном ПМСФ химотрипсине76положения линий – 121 и 155 см-1.

Ширины лоренцевых линий аппроксимации как дляхимотрипсина, так и для БСА составляют около 100 см-1.Если сравнить результаты аппроксимации нативных БСА и химотрипсина срезультатами, изложенными в главе 4, параграф 1, то получается хорошее соответствиеотмеченной там закономерности. Как было сказано выше, низкочастотная часть спектра БСА,-1α-спирального белка, аппроксимируется двумя линиями с частотами на 118 и 168 см , анизкочастотная часть спектра β-структурного белка химотрипсина линиями на 115 и 148 см-1.Следовательно, суперпозиции этих линий будут давать линию со смещенными друготносительно друга пиками – в низкочастотную область у β-структурного белка и ввысокочастотную область у α-спирального белка.Дополнительной иллюстрацией к изменениям, происходящим со спектрами белков вдиапазоне широкой низкочастотной линии при структурной модификации молекул, могутслужить результаты обработки, представленные на Рис. 32 и Рис.

33.Рис. 32. ИК спектры термически денатурированного химотрипсина (1), смеси химотрипсина с ТКЭФ (2), смесихимотрипсина с ДТТ (3) и нативного химотрипсина (4).Сначала спектры приводились к общему фоновому сигналу в диапазоне 70 – 600 см-1,после чего в интересующем нас диапазоне 50 – 200 см-1 проводилось вычитание линейной77фоновой компоненты, далее получившиеся спектры нормировались каждый на свой максимумлинии в предствленном диапазоне.На Рис. 32 представлены ИК спектры нативного химотрипсина (4), термическиденатурированного (1), а также химотрипсина, провзаимодействовавшего с ТКЭФ (2) и ДТТ(3) в диапазоне 70 – 200 см-1.