Диссертация (Низкочастотные колебательные спектры молекул белков как характеристики их структурных изменений), страница 17

Во всех спектрахмодифицированных белков, за исключением белков с ДТТ, присутствуют спектральныелинии, сдвинутые до 375 см-1. Отмеченные здесь линии 280, 360 и 375 см-1 не являютсялиниями реагентов, так как в спектрах чистых реагентов с соответствующими исследуемымобразцамконцентрациямиэтилинииотсутствуют.83Аналогичныеизмеренияввысокочастотном диапазоне «отпечатков пальцев» подтверждают отсутствие характерныхлиний спектров реагентов в смесях при используемых концентрациях.На частотах 410 и 425 см-1 во всех спектрах образцов БСА наблюдается дублет (А6,А7).

Как и для ряда обсуждаемых ранее линий, взаимодействие с ДТТ не приводит кзначительным изменениям в спектрах. Тем не менее, в остальных образцах происходитуменьшение в интенсивности низкочастотной компоненты дублета и увеличение еговысокочастотной компоненты. Это так же укладывается в концепцию о том, чтовзаимодействие с реагентами приводит к денатурации БСА, вследствие которой α-спиралиразворачиваются и образуются β-структурные слои. Одиночный пик на частоте 450 см-1 вспектрах нативного БСА и его образца с ДТТ (А8) преобразуется в дублет в спектрахостальных образцов со второй линией на частоте 460 см-1 (А8,А9). Практически такой жедублет наблюдается в спектрах денатурированных образцов химотрипсина, но еговысокочастотнаякомпонентаявляетсяболееинтенсивной(Х8,Х9).Вспектреингибированного химотрипсина отношение интенсивностей компонент противоположно.Однако,вспектренативногохимотрипсинадублетфактическинепроявляется,высокочастотная компонента на частоте 460 см-1 незначительно интенсивней.

Денатурацияведет к увеличению интенсивности плеча линии на частоте 450 см-1 (Х10), наиболее сильноона проявляется в спектре термически денатурированного белка. Ингибирование приводит ксдвигу линии нативного химотрипсина в высокочастотную область на частоту 465 см-1 (Х11).В целом, в диапазоне 100 – 480 см-1 к наиболее существенным спектральнымизменениям приводит термическая денатурация белка.Диапазон частот 500 – 550 см-1 относится к диапазону дисульфидных мостиков белка.Общепринято, что линии на частотах 510, 525 и 540 см-1 приписываются к гош-гош-гош, гошгош-транс и транс-гош-транс конформациям дисульфидных мостиков [144].

В спектренативного БСА присутствует единственная в этом диапазоне линия на 506 см-1, что говорит опреимущественной гош-гош-гош конформации мостиков. Термическая денатурация БСАприводит к незначительным изменениям мостиков, которые проявляются в сдвиге линии ввысокочастотную область. При взаимодействии с ДТТ происходит разрыв дисульфидныхмостиков в молекуле белка и образование аналогичных связей в окисленном ДТТ (транс-4,5дигидроксм-1,2-дитиан). В результате наблюдается существенное увеличение интенсивностисмещенной в высокочастотную область линии, которая приписывается окисленному ДТТ, а небелку.

Взаимодействие с ТКЭФ также приводит к разрыву дисульфидных связей в молекулебелка, но, в этом случае не происходит формирование новых мостиков, в связи с чем в спектренаблюдается существенное уменьшение интенсивности линии в диапазоне 500 – 550 см-1, чтоуказывает на практически полное разрушение мостиков в модифицированном образце.84КР спектры образцов с химотрипсином показывают, что денатурация слабо влияет наконформацию дисульфидных мостиков этого белка. Ингибирование и взаимодействие с ТКЭФведет к сдвигу наиболее интенсивной линии с частоты 510 см-1 на частоту 515 см-1 иувеличению относительной интенсивности линии на 540 см-1. Интенсивность линии 515 см-1 вКР спектре образца химотрипсин–ДТТ увеличивается в связи с образованием дополнительныхмостиков в спектре окисленного ДТТ, при этом линия на 540 см-1 остается практическинеизменной.

Сравнение данных для двух белков в этом диапазоне позволяет сделать вывод,что химотрипсин более стабилен, чем БСА по отношению к агентам, вызывающим разрывдисульфидных связей.Таким образом, КР спектры подтверждают разрыв дисульфидных связей в молекуле БСАпри взаимодействии с ТКЭФ и ДТТ. Тем не менее в ИК спектрах не наблюдаютсясоответствующие этому факту изменения. В связи с этим можно отметить, что линиидисульфидных связей в ИК спектрах не проявляются.Заключение к главе 5Низкочастотные ИК и КР спектры БСА и химотрипсина в целом похожи друг на друга.Тем не менее, присутствуют некоторые спектральные различия, что может объяснятьсясущественно различающейся вторичной структурой двух исследуемых белков.По результатам работы могут быть сделаны следующие выводы:1.

Наиболее значительные структурные изменения в молекулах белков происходят врезультате процесса термической денатурации.2. Согласно полученным результатам ИК спектроскопии, молекула бычьего БСА, αспирального белка, является более устойчивой по отношению к воздействиям на неевнешних факторов различной природы.3. Изменения некоторых линий спектров модифицированных образцов схожи.В частности, результаты ИК-Фурье спектроскопии по химотрипсинупоказывают, что амплитуда линии на частоте 255 – 260 см-1 увеличивается,если спектры упорядочить в следующей последовательности: натвный белок,образец с ДТТ, образец с ТКЭФ, термически денатурированный белок.Интенсивность этой линии в спектрах БСА также увеличивается практическив такой же последовательности образцов: нативный белок, образец с ДТТ,термически денатурированный белок и образец с ТКЭФ. Для таким образомупорядоченных спектров белков также можно отметить уменьшение линии начастоте 403 см-1 в спектрах обоих белков.

Эта же последовательность85применима для описания изменений линии спектра химотрипсина на частоте255 см-1 – происходит увеличение интенсивности этой линии по отношению клинии на частоте 235 см-1. Такие же изменения происходят с линиями на этихчастотах в спектрах БСА – 225 и 230 см-1. В спектрах обоих белковнаблюдаются линии на частотах 410 и 425 см-1.

В БСА интенсивностьнизкочастотной компоненты выше, в то время как в химотрипсине, наоборот,более интенсивной является высокочастотная компонента. Аналогичноесоотношение интенсивностей наблюдается для линий на частотах 450 и 460см-1. В уже установленном ранее порядке следования образцов интенсивностьлинии 450 см-1 в КР спектре химотрипсина увеличивается, а в БСА становитсяболее интенсивной вторая компонента – на 460 см-1.4. Ингибирование химотрипсина приводит к серьезным изменениям в структурехимотрипсина.Ингибированиебелка,какрезультатвзаимодействияотносительномаленькой молекулы ингибитора (ПМСФ) с активным центром и связывающимкарманом молекулы белка (Mхт/Mпмсф=150), можно рассматривать каклокальное взаимодействие. В связи с этим, можно ожидать незначительныхизменений спектров ингибированного белка (особенно в низкочастотнойобласти).

Тем не менее, измеренные спектры нативного и ингибированогобелков существенно отличаются друг от друга. В соответствии с общейконцепцией связи структуры молекулы с ее функционированием этот фактозначает, что связывание с лигандом вызывает конформационные изменениямолекулы белка.Можно также отметить тот факт, что спектральные изменения,вызываемые процессом ингибирования белка агентом ПМСФ аналогичны тем,что происходят при использовании другого лиганда – антраниловой кbслоты[145].

В обоих случаях происходит перераспределение интенсивностей линий на510 и 540 см-1, которое может являться результатом трансформации гошгош-гош конформации в транс-гош-транс конформацию. Этот результатявляется ожидаемым, так как конформация дисульфидных мостиков, которыене находятся в прямом контакте с активным центром химотрипсина, недолжны быть чувствительными к типу лиганда.5. КР спектры белков, провзаимодействовавших с ДТТ и ТКЭФ значительно отличаютсяот спектров нативных белков.86КР спектры показывают, что, во-первых, ТКЭФ обеспечивает практически полныйразрыв всех дисульфидных мостиков в молекуле БСА и, во-вторых, при взаимодействии сДТТ разрыв мостиков в молекуле белка сопровождается образованием мостиков вмолекуле окисленного ДТТ.

Учитывая отсутствие значительных изменений в ИК спектрах,можно заключить, что линии дисульфидных мостиков в этих спектрах не наблюдаются.В соответствии с опубликованными экспериментальными данными и теоретическимирасчетами, линии амид VI и амид VII должны наблюдаться в спектральных интервалах 500– 610 см-1 и 160 – 250 см-1, соответственно [146,147,148,149,150]. Спектры химотрипсина иБСА в этих диапазонах имеют различия, что согласуется с наличием различной вторичнойструктуры у этих белков. Взаимодействие с химическими реагентами и термическаяденатурация также приводит к спектральным изменениям в этих диапазонах.ЗаключениеМетодынизкочастотнойспектроскопиипозволяютрегистрироватьлинии,чувствительные к изменениям конформаций белковых молекул, что может быть использованопри исследовании их функционирования с применением концепции «белок-машина».Низкочастотный спектральный диапазон является перспективным для анализа структуры ифункционирования биологических объектов.Основные результаты и выводы1.

Впервые измерены спектры терагерцового поглощения и низкочастотные ИК-Фурьеспектры лиофилизованных смесей химотрипсин-краун. Выявлено их значительноеотличие от спектров чистых веществ, что свидетельствует о существенноммежмолекулярном взаимодействии при преимущественном взаимодействии краунэфира с протонированными аминогруппами.2. Выявленыотличиянизкочастотныхколебательныхспектроввосьмибелков,объясняющиеся отличиями вторичных структур (например, увеличение интенсивностив полосе 130 – 190 см-1 для α-спиральных белков, как в ИК-Фурье, так и в КР спектрах имонотонное увеличение интенсивностей в диапазоне 220 – 260 см-1 и на частоте 333 см1в ИК-Фурье спектрах белков с увеличением содержания β-структур).3.

Установлено, что низкочастотные ИК-Фурье спектры суперспиральных белков(фибриногена и коллагена) существенно отличаются от спектров глобулярных белков.874. Отсутствие корреляций значительных изменений в низкочастотных КР спектрах белковв диапазоне 200 – 470 см-1 с содержанием элементов вторичной структуры и/илимолекулярным весом и неспецифичность колебаний этого диапазона по отношению котдельным аминокислотным остаткам позволяют предположить связь спектральныхизменений с различиями в третичной и/или четвертичной структурах молекул.5.

Разрыв дисульфидных мостиков в молекуле белка и термическая денатурация приводятк существенным изменениям в низкочастотных колебательных спектрах (например,увеличению интенсивности в диапазоне 200 – 280 см-1 и перераспределениюинтенсивностей в полосе 370 – 440 см-1 ИК-Фурье спектров, перераспределениюинтенсивностей в интервале 100 – 200 см-1 КР спектров, высокочастотному сдвигулинии 325 см-1 в КР спектрах БСА и образованию дублета в интервале 220 – 260 см-1 вКР спектрах химотрипсина.6.