Диссертация (Моделирование структуры липополисахаридов и их роли в процессе патологического свертывания крови), страница 11

Как и ранее,на первом этапе уравновешивания были использованы термостат и баростат Берендсена, навтором — термостат Нозе-Гувера и баростат Парринелло-Рамана.После достижения системами равновесной площади, бислой 16 Ra-LPS/16 Ra-LPS былиспользован для построения первой модели чистого ЛПС бислоя. Мы использовали PyMOLдля присоединения цепей О-антигена, состоящих из 12 повторяющихся звеньев, к половинеслучайно выбранных молекул Ra-LPS одного из монослоев.Сборка стартовой конформации второй, белок-содержащей мембраны осуществлялась внесколько этапов:1.В качестве модельной структуры белка была использованаструктуру 1BXW трансмембранного домена OmpA[248]. Последовательностьгена A0A023I6S3 (22–192 a.a.) была выровнена относительно разрешенных в кристалле 1XBWT аминокислот, а финальная модель была построена с использованиемметода моделирования по гомологии (MODELLER v9.11 [251]).Подготовка белка OmpA.E. coli442.

Растворение первой молекулы белка. Молекулы воды были удалены из уравновешенного9Ra-LPS/9 Ra-LPS бислоя. Используя PyMOL, мы удалили по две соседние мо-лекулы из каждого монослоя (удаленные молекулы находились друг напротив друга всоседних монослоях). На их место была помещена молекула белка. Конечная системасодержала семь молекул Ra-LPS на монослой и одну молекулу белка, раствореннуюв бислое.

Для такой системы был проведен уравновешивающий100 нсрасчет в NVTансамбле, в ходе которого координаты атомов основной цепи белка были фиксированы.3. Растворение второй молекулы белка. Молекулы воды были удалены из системы, приготовленной на шаге2.Затем мы удалили еще по две соседние молекулы в каждоммонослое, и поместили на их место вторую молекулу белка.

Финальная система содержала5молекул Ra-LPS на монослой иводном растворе0.1 M2молекулы OmpA. Модель была растворена в+NaCl с добавлением ионов Na для нейтрализации отрицатель-ного заряда. Нами был проведен10 нс уравновешивающий расчет при температуре 50 Kв NVT ансамбле, а затем — уравновешивающий100 нсрасчет при температуре300 KвNSpT ансамбле. Аббревиатура “NSpT” используется нами для случая расчетов в NPTансамбле при использовании анизотропного баростата с очень малыми коэффициен-9−1тами сжимаемости вдоль направления X/Y (10 бар·нм ), позволяющего выровнятьпаскалево давление в системе при фиксированной площади бислоя.

В ходе уравновешивающих расчетов координаты атомов основной цепи белка также были фиксированы.4. Присоединение цепей О-антигена к внешнему монослою. С помощью PyMol мы присоединили цепи О-антигена к каждой молекуле Ra-LPS одного из монослоев мембраны.В качестве начальной конформации цепи О-антигена была выбрана энергетически выгодная спираль (см. раздел 1.2.1 главы 4). Затем результирующий бислой O12-LPS/RaLPS/OmpA был вновь растворен в растворе0.1 M NaCl с добавлением катионов натриядля нейтрализации отрицательного заряда. После серии расчетов минимизации энергии было проведено уравновешивание в NVT ансамбле при температуре370 нс,50 K в течениепри фиксировании координат атомов основной цепи белка.5.

Подготовка стартовой структуры бислоя. Вода и ионы были удалены из системы,собранной на шаге4.С учетом периодических граничных условий система была дуб-лирована вдоль направлений X и Y, что привело к увеличению ее объема вОкончательная система содержала20O12-LPS,20Ra-LPS,8белков OmpA.4раза.45Для начальных конфигураций чистой и содержащей белок ЛПС-мембран была проведена минимизация энергии и уравновешивающий расчеты в NVT ансамбле до достижениясистемой нормального латерального давления. Далее, для интенсификации процесса сканирования конформационного пространства О-антигенов для каждой мембраны были проведены 300 нс МД расчеты в вакууме при температуре О-антигенов равной 600 K и температуреостальной части мембран равной 50 K в NVT ансамбле.

Полученная структура мембраныбыла далее помещена в раствор 0.1 M NaCl с добавлением нейтрализующих заряд ионовнатрия, и для каждой системы мы провели 500 нс уравновешивающие расчеты при общейтемпературе 303 K с использованием стандартного протокола.1.4Обработка результатов расчетовДля визуализации молекулярных сцен были использованы пакеты PyMOL [246] и VMD [252].Обработка количественных данных выполнялась с помощью программ собственной разработки на языке Python с использованием библиотек numpy и scipy [253]. Графики были построены с использованием библиотеки matplotlib [254]. Энергетически выгодная спиральнаяструктура молекулы O12-LPS в разделе 1.2.1 главы 4 была построена с помощью самодельного скрипта на основе PyMOL, который устанавливает каждый двугранный угол вокругO-гликозидной связи в энергетически выгодное положение.

Минимизация энергии полученной структуры была проведена с использованием стандартной процедуры GROMACS.Оценка подвижности различных компонентов моделируемых систем проводилась при расчете среднеквадратического отклонения структуры (rout mean square luctuation, RMSF) сфиксированным шагом равным 1 нс с использованием утилиты GROMACS gmx rmsf.1.4.1Анализ конформаций цепочки О-антигенаОдним из общепринятых критериев, используемых для описания конформаций углеводныхполимеров, являются значения двугранных углов (�, �) вокруг O-гликозидных связей [28,29, 223, 224, 255–257]. В нашей работе мы измеряем эти углы относительно атомов водорода:� = H1-C1-OX-CX, � = C1-OX-CX-HX (рис.

2.2 A), как это было ранее сделано во многихмодельных и экспериментальных исследованиях [28, 223, 224, 256, 257].В то время как рассмотрение углов (�, �) дает достаточную информацию о конформационном поведении цепочек при фиксированных конформациях остатков моносахаридов, учетконформационной подвижности пиранозных колец привносит дополнительные степени свободы, не описываемые изменением углов (�, �). Изменения конформаций углеводных колец46ABGalGalφχψφψθManχRhaRhaManχθРис. 2.2: Двугранные углы, использованные для анализа конформационной подвижностиО-антигенной цепи. Классические углы(�, �)(A) и нативные углы(�, �)(B) отмечены нафрагменте полисахаридной цепи О-антигена S. typhimurium. Прямые стрелки показываютнаправление измерения двугранных углов. Красные линии добавлены для визуализации нативных двугранных углов.могут существенно влиять на пространственную структуру молекулы [25, 29, 30], поэтому мыпредлагаем альтернативный подход для описания подвижности длинной гибкой цепи и вместе с классическими углами рассматриваем “нативные” двугранные углы, образованные углеродными атомами гликозидных связей (рис.

2.2 B). Эти углы(�, �) можно легко представить,если соединить воображаемой линией атомы углерода последовательных O-гликозидных связей (рис. 2.2 B, красные линии). Угол�отражает конформацию углеводного остатка, а угол� описывает конформацию O-гликозидной связи между остатками. Мы использовали три пары таких двугранных углов для анализа конформаций цепочек О-антигена:(�Rha , �RhaGal )1.4.2и(�M an , �M anRha ),(�Gal , �GalM an ).Расчет свободной энергииРасчет относительной свободной энергии конформаций О-гликозидных связей для молекулдисахаридов был проведен с использование метода потенциала средней силы (Potential ofMean Force, PMF). Для каждой конформации �, энергия рассчитывалась, исходя из отношения количества реализаций этой конформации (�i ) к количеству реализаций наиболее часто47встречающейся конформации (� ), свободная энергия которой принималась равной нулю:∆� = −�� ln�i.�Достижение распределением заселенностей равновесного состояния было оценено сравнением результирующих распределений энергий для полной траектории с распределениями,рассчитанным для ее частей.2Численное решение уравнений в частных производныхИнтегрирование реакционно-диффузионных моделей, описывающих основные реакции каскада свертывания крови, рассматриваемых в разделе 1 главы 3, производилось в средеMATLAB с использованием встроенного функционалаpdepe.Моделирование системы, рас-сматриваемой в разделе 2 главы 3, проводилось с помощью программы на C++, написаннойаспирантом университета Лион 1 Анассом Бушнита.

Система уравнений реакция-диффузияадвекция, описывающая динамику изменения распределения концентраций факторов крови,решалась численно с помощью метода конечных разностей. Использовалась схема против потока в дискретных конвективных членах во избежание числовых неустойчивостей в случаяхс преобладанием конвекции. Численная схема рассматривалась на двумерной сетке размером2000×400. Точность вычислений контролировалась сравнением с результатами, полученнымипри меньшем шаге интегрирования (см. раздел 1 приложения для примера дискретизации).Уравнение потока решалось численно методом проекций [258], подробно описанным в [259].Описание применения метода к нашей системе приведено в разделе 1 приложения.3Метод Лере-Шаудера доказательства существованийрешений типа пульсМетод Лере-Шаудера cостоит в построении непрерывной деформации (гомотопии) исходнойсистемы к некоторой системе, для которой известно существование решений, обладающихтребуемыми свойствами.

Для этих систем рассматривается векторное поле, порожденное имив функциональном пространстве, и предполагается существование гомотопического инварианта, а именно, вращения векторного поля, иначе называемого топологической степенью,удовлетворяющей следующим свойствам:481. Принцип отличия от нуля. Если на границе области в функциональном пространствестепень определена и отлична от нуля, то в этой области существуют стационарныеточки.2. Гомотопическая инвариантность. Если при непрерывной деформации системы решениене достигает границы области, то значение степени на этой границе неизменно.Тогда, при условии существования априорных оценок решений таких, что в процессе гомотопии решения находятся в некотором шаре в функциональном пространстве, и при условии,что для финальной системы топологическая степень на границе шара отлична от нуля, тоона также отлична от нуля для исходной системы, откуда следует существование решенийдля исходной системы.

Таким образом, для применения метода Лере-Шаудера необходимоопределить степень с указанными свойствами, и построить непрерывную гомотопическую деформацию к некоторой модельной системе, для которой степень отлична от нуля на границешара достаточно большого радиуса, при условии существования априорных оценок решений.4Интегрирование и оценка параметров для кинетической модели активации контактной системыМодели контактной активации были разработаны, опираясь на экспериментальные результаты по активации фактора XII агрегатами ЛПС в чистых системах FXII+PK [17] иFXII+PK+HMWK [18]. Полученные кинетические модели были проинтегрированы с использованием метода LSODA программы COPASI (http://www.copasi.org).

Подбор параметровмодели был осуществлен следующим образом.Мы предполагали, что один агрегат состоит изповерхности (�lps ), равную0.02 мкм2 ,8 · 103молекул ЛПС и имеет площадьоценив ее через средний радиус ЛПС-агрегатов, обра-зуемых на высоких концентрациях ЛПС (∼40 нм),в работе [260]. Объем раствора, прихо-дящийся на один ЛПС-агрегат (�sol ) был рассчитан как величина, обратная к концентрацииагрегатов в растворе. Конвертирование концентраций, измеренных в работе [17], из мкг/млв мкM производилось, считая массу одного ЛПС равной4.5 кДаНачальные концентрации FXII и PK были взяты равными[261].0.16 и 0.14 мкM, соответствен-но, как это было сделано в эксперименте [17]. Начальная концентрация сайтов связывания наповерхности ЛПС агрегатов (� ) была оценена из данных о размерах FXII.