Диссертация (Моделирование структуры липополисахаридов и их роли в процессе патологического свертывания крови), страница 7

1.2).ЛПС необходимы для выживания грамотрицательных бактерий, поскольку именно они26Рис. 1.2: Устройство клеточной стенки грамотрицательной бактерии.обеспечивают правильную сборку наружной мембраны. ЛПС — это амфифильные макромолекулы, которые образуют специфичный полупроницаемый барьер для различных классовмолекул, включая детергенты, антибиотики и токсичные красители или металлы. Барьерныесвойства наружной мембраны обусловлены ее низкой текучестью, достигаемой за счет высокой степени упорядоченности структуры и большой молекулярной массы ЛПС-монослоя.Именно молекулы ЛПС, расположенные на поверхности клетки, взаимодействуют с другимибиологическими системами, участвуя в таких взаимодействиях бактерии с клетками хозяина,как адгезия, колонизация, вирулентность, и симбиоз. ЛПС, также называемый эндотоксином, является мощным стимулятором врожденных иммунных реакций и играет ключевуюроль в патогенезе грамотрицательных инфекций у растений и животных [169].2.1Структура ЛПСВ большинстве бактерий ЛПС имеет стандартную общую структуру, включающую в себятри домена: гидрофобный фрагмент, называемый липидом A, гидрофильный гликан, называемый O-специфическим полисахаридом (также известный как O-антиген) и связывающийих друг с другом центральный или коровый олигосахарид.

Углеводная цепь экспонированана поверхности клетки, в то время как липид А участвует в формировании гидрофобно-27го бислоя наружной мембраны и, таким образом, заякоривает молекулы ЛПС [167, 170]. Всилу особенностей структуры поверхности клеток, различимой под электронным микроскопом, штаммы бактерий, экспрессирующие полноразмерные молекулы ЛПС, содержащая всетри домена, получили название “гладких” (“smooth”, S-LPS), тогда как штаммы не имеющие O-антигенной цепи и/или частей центрального олигосахарида были названы “грубыми” (“rough”, R-LPS).2.1.1Липид АПрактически все иммуногенные свойства молекулы ЛПС связанны с присутствием в ееструктуре липида А [166, 170, 171].

Липид А действует как мощный стимулятор врожденной иммунной системы, так как он непосредственно связывается с Толл-подобным рецептором TLR4 [172, 173], что вызывает широкий спектр биологических эффектов, от повышенияуровня устойчивости к инфекции до неконтролируемого и массивного иммунного ответа,приводящего к сепсису и септическому шоку. Биоактивность липида А, включая способность взаимодействовать и активировать рецепторы иммунной системы, сильно зависит отего химической структуры.В большинстве изученных на сегодняшний день бактерий основой липида А являетсядисахарид N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc I и II), каждый из моносахаридов которогофосфорилирован и ацилирован двумя 3-гидрокси жирными кислотами в положениях 2 и 3через амидные и сложноэфирные связи. Первичные ацильные цепи (общим числом четырештуки), непосредственно связанные с углеводной основой, могут быть ацилированы вторичными ацильными цепями по гидрокси-группе. Один или оба остатка GlcNAc могут бытьтакже заменены остатками 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкопиранозы (GlcN3N).

Фосфатные группы могут быть замещены другими полярными группами или же одна из фосфатныхгрупп может отсутствовать [174]. Таким образом, хотя липид A и является наиболее консервативной частью молекулы ЛПС, структура его весьма вариабельна, так как количествофосфатных групп и их заменителей, а также количество и длина ацильных цепей можетразличаться [165].2.1.2Центральный олигосахаридЦентральный олигосахарид (кор) может быть условно разделен на две части: проксимальную — внутреннее ядро, и дистальную, расположенную, ближе к О-антигену — внешнее ядро. Внутреннее ядро содержит, по меньшей мере, один остаток 3-дезокси-D-манно-28окт-2-улозоновой кислоты (Kdo) и несколько остатков L-глицеро-D-манно-гептозы (L,DHep) [166, 175, 176]. Kdo редко встречается в других углеводах и поэтому может рассматриваться как маркер присутствия ЛПС. Внутренне ядро часто содержит и иные заместители, обычно присутствующие в нестехиометрических количествах: фосфаты, дифосфат, 2аминоэтилфосфат или 2-аминоэтилдифосфат, уроновые кислоты (D-GalA) и различные модифицированные остатки, такие как, например, 4-амино-4-дезокси-L-арабиноза (L-Ara4N).Внешнее ядро демонстрирует большее структурное разнообразие, чем внутреннее ядро.

Подробный обзор его различных структур представлен в [174]. Наиболее часто встречающимисяуглеводами внешнего ядра являются D-глюкоза, D-галактоза и N-ацетил-D-глюкозамин [173].За счет электростатических взаимодействий анионные группы, присутствующие в составе2+центрального олигосахарида и липида А, связываются с двухвалентными катионами (Mg2+и Ca ), тем самым сшивая молекулы ЛПС друг с другом. Этот эффект существенно увеличивает устойчивость внешней мембраны и снижает ее проницаемость, тем самым усиливаяее барьерные свойства [164, 177, 178]. В то же время, отрицательно заряженные группы частоявляются мишенью для антимикробных катионных пептидов. При этом, присутствие остатков 4-амино-4-дезокси-L-арабинозы (Ara4N) в составе липида А ЛПС многих бактерий можетэкранировать отрицательный заряд ЛПС и повышать устойчивость бактерии к воздействиюантимикробных препаратов.2.1.3О-антигенО-антиген является самым внешним гидрофильный доменом молекулы ЛПС, который обязан своим названием способности индуцировать адаптивный иммунный ответ.

По своей химической структуре О-антиген представляет собой полисахарид, содержащий до50оли-госахаридных повторяющихся звеньев (repeating units, RU), каждый фрагмент состоит издвух-восьми гексозных или пентозных остатков и может быть линейным, либо разветвленным [173, 174, 179]. Химический состав О-антигена и его длина являются биологическимимаркерами вирулентности [24, 173], и их различия являются определяющим фактором прибактериальной серологической типизации [174, 180]. В “гладких” бактериальных штаммахгетерогенный слой О-антигенов предоставляет дополнительную защиту от комплемента иантител хозяина и значительно влияет на способность бактерий адаптироваться к окружающей среде [24, 181, 182]. Возможный защитный механизм, обеспечиваемый слоем О-антигена,был предложен по результатам анализа адгезии клеток E.

coli на кварцевую поверхность.Была выдвинута гипотеза о том, что О-антигены вносят вклад в устойчивость мембраны29путем экранирования отрицательно заряженных частей центрального олигосахарида и липида А [183].Распределение длин О-антигенов в реальных мембранах обычно имеет три пика, соответствующие коротким (< 4 RU), длинным (10–40 RU) и очень длинным (> 90–100 RU) цепям,что влияет на бактериальную устойчивость к атаке комплемента и поглощению макрофагами [24, 181]. Бактерии штаммов Salmonella typhimurium с очень большими модальнымидлинами О-антигенов (> 100 RU) полностью устойчивы к поедание макрофагами. Клетки скороткими О-антигенами, состоящими из 2–4 RU, очень чувствительны к воздействию комплемента, тогда как ЛПС с > 10 RU устойчивы к действию системы комплемента.

Былоустановлено, что минимальная длина О-антигена, обеспечивающая защиту от атаки комплемента, составляет от 4 до 15 повторяющихся звеньев [24].Разнообразие химического состава повторяющихся звеньев, а также структуры идлины О-антигенов делают их наиболее вариабельной частью ЛПС. Основными экспериментальными подходами, используемыми для определения первичной структуры Оантигенов служат методы гидролиза и различные виды хроматографии с последующей массспектрометрией [184]. На сегодняшний день химический состав О-антигенов достаточно хорошо охарактеризован и подробно описан в [174].2.2Влияние структуры ЛПС на биологическую активностьРазвитие сепсиса в ответ на попадание в кровь ЛПС напрямую связано с их взаимодействиемс клетками хозяина: клетками эндотелия, моноцитами, нейтрофилами, и макрофагами.

Клеточная активация ведет к повышенному уровню экспрессии воспалительных цитокинов всеми перечисленными типами клеток, а также к экспрессии ТФ на моноцитах и эндотелии [2],и возможно, запуску апоптоза эндотелиальных клеток [144]. Такая воспалительная реакцияв совокупности с активацией системы комплемента и повышением уровня микровезикул ведет к усиленной активации системы свертывания и диссеминированному внутрисосудистомутромбозу.Распознавание клеточной поверхностью ЛПС как в случае клеток эндотелия [185], так илейкоцитами [186], осуществляется при взаимодействии ЛПС с комплексом Толл-подобногорецептора 4 (Toll-like receptor 4, TLR4) и белка MD-2 [187,188].

Распознавание ЛПС происходит после его связывания с ЛПС-связывающим белком (LPS-binding protein, LBP). LBP переносит ЛПС на мембранный белок CD14 [189], который связывается к комплексом LPS-LBPи облегчает перенос ЛПС на белок MD-2, который, в свою очередь, связан с внеклеточным30доменом TLR4 [190]. Связывание с ЛПС способствует димеризации мембранного комплексаTLR4/MD-2, что запускает сигнальные пути, активирующие экспрессию цитокинов [2].Взаимодействие ЛПС с комплексом TLR4/MD-2 существенно зависит от надмолекулярной структуры ЛПС. Из-за их амфифильной природы молекулы ЛПС имеют тенденциюобразовывать агрегаты, биологическая активность которых может во многом превышатьактивность отдельных молекул ЛПС [19, 191]. Существует гипотеза, согласно которой мономеры ЛПС ответственны за активацию комплекса TLR4/MD-2 через связывание с мембранным рецептором CD14, а агрегаты ЛПС могут активировать комплекс без взаимодействияс CD14 [21, 192].

Это предположение косвенно подтверждается тем фактом, что при низких концентрациях ЛПС CD14 оказывается необходим для активации экспрессии цитокиновмакрофагами, в то время как при высоких концентрациях их активация от CD14 не зависит [193, 194].Принципиальную роль в образовании агрегатов и степени биологической активности ЛПСиграет липид А, который отвечает за связывание ЛПС с рецепторами и, тем самым, обеспечивает эндотоксическую активность ЛПС [22, 195–199]. Определяющими факторами уровняагонистической или антагонистической активности липида А является плотность отрицательного заряда на полярных головках, а также угол наклона дисахаридной основы и общаяформа молекулы. Наклон гликозидной связи относительно гидрофобной области определяетто, насколько аномерный фосфат на GlcN I экспонирован за пределы поверхности наружноймембраны. В совокупности с величиной заряда на полярной головке, структура гидрофильной основы липида А определяет специфичность его связывания с целевыми рецепторами [174].

В то же время гидрофобная область в значительной степени определяет последующую активацию иммунного ответа [192]. Только виды, чья первичная структура ЛПС придает коническую форму молекуле, являются эндотоксически активными [200]. Гидрофобнаячасть липида А, в этом случае, имеет большое поперечное сечение и может взаимодействовать с сайтами гидрофобного связывания комплекса TLR4/MD-2, активируя трансмембранную сигнализацию. Виды с липидом А цилиндрической формы не способны индуцироватьсоответствующее механическое напряжение для активации рецепторов [200]. Различия в пространственной структуре липида А также существенно сказываются на структуре и активности образуемых агрегатов. Только молекулы ЛПС, образующие неламеллярные (кубическиеили гексагональные) агрегаты, являются биологически активными [197–199, 201].Полисахаридная составляющая ЛПС также оказывает существенное влияние на форму,структуру и активность надмолекулярных ЛПС-структур.