Диссертация (Моделирование структуры липополисахаридов и их роли в процессе патологического свертывания крови), страница 9

В расчетах для чистых ЛПС-бислоев было показано, чтоплощадь, приходящаяся на один липид А, возрастает, а степень упорядоченности гидрофобного бислоя уменьшается по мере добавления большего количества компонентов ЛПС, что,видимо, указывает на менее плотную упаковку липида А в ЛПС-мембранах “гладких” клетокпо сравнению с “грубыми” штаммами. Интересно, что более 50% координационных сайтов2+Caлипида А и центрального олигосахарида заняты молекулами воды, что подтверждает2+важность воды и Caдля стабилизации и поддержания целостности структуры наружноймембраны [27]. Это наблюдение согласуется с другими исследованиями, свидетельствующими2+о том, что ионы Caблагоприятствуют поддержанию ламеллярной структуры S- и R-LPSмембран при температурах 283–343 К и физиологическом содержании воды [214, 217].С точки зрения динамики поведения различных компонентов ЛПС, как липид А, так ицентральный олигосахарид демонстрируют малую подвижность по сравнению с фосфолипидами, и степень их подвижности в модельных расчетах не зависит от наличия и длиныполисахаридной части, а также от гетерогенности бислоя [25–27].

Этот факт согласуетсяс другими исследованиями, показавшими, что латеральная диффузия липида А на порядок медленнее диффузии фосфолипидов [219]. Жесткость и низкая подвижность липидов Аи остатков центрального олигосахарида, в основном, объясняются латеральными взаимо-2+действиями через двухвалентные ионы Caза счет электростатических взаимодействий с2−−отрицательно заряженными группами PO4 и COO .O-антигенные цепи, напротив, оказываются гибкими в модельных расчетах, причем степень их подвижности последовательно увеличивается от ближайшего к плоскости мембраны повторяющегося звена к более дистальным остаткам [25, 27].

При этом подвижность Оантигенных цепей существенно зависит от состава мембраны, влияющего на плотность упаковки О-антигенов и оказывается выше для гетерогенных бислоев [25, 27]. Распределениемолекул ЛПС в реальной наружной мембране существенно неоднородно и учет присутствияв составе мембраны молекул разного типа, по-видимому, является необходимым условиемдля реалистичного воспроизведения укладки О-антигенных цепей на ее поверхности.Второй важной проблемой создания моделей гладких ЛПС мембран является выбор на-35чальной конформации О-антигенных цепей. В пространстве конформаций длинные и гибкиеО-антигенные цепочки имеют очень сложный ландшафт свободной энергии, и искусственныйвыбор начального состояния может привести к тому, что структура цепи никогда не сможет достичь нативного состояния в МД расчете.

Синтезированные на внутренней мембране,ЛПС транспортируются на поверхности клетки в ограниченном количестве специальныхсайтов [167, 220]. Таким образом, первичная укладка О-антигенной цепи начинается еще допереноса ЛПС во внешнюю мембрану, и эта предварительная стадия определяет дальнейшуюэволюцию конформации О-антигена в составе мембраны. Детальное описание конформационной подвижности свободных О-антигенов в растворе необходимо для корректного выбораначального состояния и анализа поведения О-антигенов в мембранном окружении.Экспериментальное изучение конформационного поведения цепей О-антигенов представляет большую методологическую сложность.

По своей природе олигосахариды трудно кристаллизуются, что не позволяет использовать рентгеноструктурный анализ для исследования их конформаций. Таким образом, основным методом исследования пространственнойструктуры полисахаридов и О-антигенов является ЯМР. Интерпретация данных ЯМР чащевсего выполняется при помощи молекулярного моделирования. Активное изучение строенияи биологических свойств О-антигенов бактерий, а также разработка методов структурного анализа сложных углеводов ведется в лаборатории под руководством Ю.А.

Книреля изИнститута органической химии РАН [174]. Исследования по определению первичной последовательности О-антигенов бактерий самых разнообразных таксономических групп с последующей ЯМР спектроскопией коротких фрагментов О-антигена в растворе ведутся группойАнтонио Молинаро [221]. Конформационные изменения ЛПС при взаимодействии с белкамиэкспериментально исследуется в двух лабораториях соседних институтов Потсдама: Стефани Барбирц из Университета Постдама и Марка Сантера из Института Коллоидной Химииимени Макса Планка [222]. Большое количество работ по описанию конформаций дисахаридов и коротких фрагментов олигосахаридов в растворе было выполнено в ряде другихлабораторий [28, 29, 223–226].Основными параметрами, используемыми для описания конформаций полисахаридныхцепей являются двугранные углы поворота вокруг O-гликозидных связей между остатками, а также конформации углеводных колец.

Для всех рассмотренных на сегодняшний деньфрагментов О-антигена, как данные ЯМР, так и МД моделирование демонстрируют предпочтительность син -конформаций гликозидных связей, обеспечивающих максимальную удаленность остатков друг от друга [28, 29]. Помимо этого энергетического минимума, такиемолекулы часто обладают локально выгодными анти -конформациями, в которых один из36O-гликозидных двугранных углов принимает значения околодел 1.4.1 главы 2).Анти -�180 ∘[28, 223, 224] (см. раз-конформации обычно имеют более низкую энергию, чеман-ти -� [28, 30].Энергетически выгодной конформацией пиранозных колец для большинства углеводных остатков является кресло (1 C4 или 4 C1 ), в котором наиболее объемные заместители ориентированы экваториально, то есть максимально удалены друг от друга [227]. Относительная устойчивость энергетически выгодных конформаций колец и преобладаниесин -конформацийO-гликозидных связей в коротких олигосахаридах приводит к тому, уг-леводные цепочки большей длины образуют спиральные структуры, параметры которыхмогут быть получены из данных ЯМР [29].Тем не менее, выводы о конформационной подвижности и предпочтительных состоянияхдля коротких олигосахаридов не могут быть непосредственно экстраполированы на длинные полисахаридные цепи и не дают достаточной информации о поведении, в частности,длинных цепочек О-антигенов, наблюдаемых у резистентных патогенных штаммов.

Интерпретация результатов ЯМР даже для цепей длиной порядка10 повторяющихся звеньев суще-ственно затруднена, и метод позволяет лишь отметить наличие конформационной подвижности цепи на разных временных и пространственных масштабах [228]. МД моделированиев неявном растворителе О-антигенаSh. lexneri, состоящего из четырех[30] и10тетрасаха-ридных RU [31], показало наличие значительных структурных флуктуаций, обусловленныхвзаимодействием удаленных частей молекулы. Уже при такой длине цепи удается получитьконформации, не наблюдающиеся для более коротких фрагментов [30, 31]. В главе 4 мы проводим детальное МД исследование конформационной подвижности относительно длиннойцепи О-антигена (12 повторяющихся звеньев) в различном окружении, а также анализируемвлияние различных компонентов ЛПС на структуру образуемых агрегатов и архитектуруЛПС-мембран.Глава 2Методы1Подготовка и проведение МД расчетов1.1Создание молекулярных топологийМодели молекул дисахаридов и цепи О-антигена были разработаны на основе силовых полей OPLS-AA [229] и GLYCAM06 [230] (модификация AMBER99 [231]).

Парциальные зарядыатомов остатков�-D-маннозы, �-D-галактозыи�-L-рамнозылового поля GLYCAM06 [230]. Парциальные заряды атомовтакими же, как для�-D-галактозы,были вычислены авторами си-�-D-абеквозы были установленыа парциальные заряды для восстановленных атомов C3и C6 были взяты из аналогичных химических фрагментов в силовом поле AMBER99 [231].Основным полем, используемым для расчетов ЛПС-мембран и ЛПС-мицелл, было полеOPLS-AA [232], первоначально параметризованное для воспроизведения основных термодинамических свойств органических жидкостей [229].

Поле OPLS-AA содержит большое количество разных типов атомов, что позволяет подробно описывать молекулы с разнообразнойхимической структурой. В терминах силового поля OPLS-AA, все типы атомов делятся нагруппы в соответствие с их химическим окружением. В результате, атомы с аналогичнымихимическими свойствами могут иметь разные парциальные заряды и одинаковые потенциалы валентных взаимодействий с соседними атомами.

Это свойство позволяет значительноуменьшить количество возможных комбинаций типов атомов и упрощает работу с силовымполем. Выбор типов атомов и создание молекулярных топологий в поле OPLS-AA было выполнено с использованием программыОсновной алгоритмTppMkTopTppMkTop, разработанной в нашей лаборатории.опирается на распознавание химического окружения мо-лекул при помощи записи химических фрагментов SMARTS с использованием библиотекиopenbabel[233].3738Входными данными дляTppMkTop являются координаты всех атомов молекулы и базаданных химических фрагментов (SMARTS), соотнесенных с типами атомов из силового поля.Программа осуществляет создание молекулярной топологии по следующему алгоритму:1.

Присвоение типов атомов:(a) построение графа связности молекулы согласно файлу структуры;(b) перебор шаблонов SMARTS из базы данных и их поиск в химической структуремолекулы с использованием функций пакета openbabel;(c) для каждого атома: выбор из шаблона, описывающего фрагмент, содержащий рассматриваемый атом, наиболее полным образом, в соответствие с системой условных приоритетов (шаблоны, описывающие более сложные химические фрагменты,имеют более высокий условный приоритет, чем шаблоны для более мелких фрагментов).2. Установка параметров валентных взаимодействий:(a) выбор параметров валентных взаимодействия в соответствие с базой данных;(b) установка параметров неправильных двугранных углов (impropers) в соответствиес базой соответствующих шаблонов.3.

Установка параметров невалентных взаимодействий:(a) определение зарядовых групп;(b) добавление параметров 1–4-взаимодействий, если это необходимо.Молекула ЛПС содержит ряд химических фрагментов, параметры которых отсутствовали в исходном силовом поле. Эти фрагменты были выделены из структуры молекулы ЛПС ввиде небольших молекул: �,�-диметоксипропионат, �-метоксиэтил фосфат и диметилпирофосфат. Для этих молекул были проведены расчеты парциальных зарядов и силовых параметров торсионных углов методами ab initio (см.