Диссертация (Моделирование структуры липополисахаридов и их роли в процессе патологического свертывания крови), страница 10

раздел 1.2). Соответствующие новые типыатомов были внесены в базу данных1.2РасчетыTppMkTop (рис. 2.1).ab initioКвантово-химические (QM) расчеты были проведены в рамках теории функционала электронной плотности (DFT) с использованием пакета Firely 8 [234] в базисе 6-31G+(1p,1d) с39Рис. 2.1: Основная схема работы программыTppMkTop по автоматическому созданию мо-лекулярных топологий.функционалом B3LYP5. Электростатический потенциал рассчитывался на поверхности Конолли [235], образованной объединением сфер с радиусом � = �vdw · 1.4 и центрами в центрахатомов.

Значения парциальных зарядов были подобраны при фитировании полученного потенциала с помощью процедуры RESP (Restrained Electrostatic Potential) [236]. Окончательные значения зарядов были выбраны в соответствие с результатами фитирования и значениями зарядов для атомов похожих типов в силовом поле OPLS-AA таким образом, чтобыпо возможности не изменять парциальные заряды для атомов известных типов.Ab initio сканирование поверхности потенциальной энергии (ППЭ) при расчетах QM потенциала двугранных углов было выполнено с использованием нового алгоритма, недавнореализованного в Firely v.8 (сканирование ППЭ по выделенной координате с релаксацией вкаждой точке в делокализованных координатах [234]).

Значение рассматриваемых двугранных углов изменялось на 5 ∘ за шаг. Минимизация энергии с фиксированными значениямидвугранного угла была выполнена в делокализованных координатах, которые перерассчитывались на каждом шаге сканирования. Как и в случае с расчетом парциальных зарядов,был использован базис 631G+(1p,1d) с использованием DFT (функционал B3LYP5). Длясдвига координат при локальной оптимизации геометрии использовался алгоритм GDIIS созначением порогового градиента 10−5 Хартри/Бор.401.3Протоколы МД расчетовОсновная часть МД расчетов была проведена с использованием программного пакета GROMACS версии 5.1.4 [237].

Финальные расчеты были проведены в изобарноизотермическом ансамбле NPT с анизотропным баростатом при нормальном и латеральном давлении равным1 бари шагом интегрирования2 фс.Использовался термостат Нозе-Гувера [238] и баростат Парринелло-Рамана [239]. Длина связей между атомами водородаи тяжелыми атомами была зафиксирована при помощи алгоритма LINCS [240].

Для расчета дальнодействующих электростатических взаимодействий был использован метода суммирования по Эвальду (Particle Mesh Ewald method, PME) с интервалами Фурье равными0.12 нм[241]. Мы использовали радиус обрезания равный1.2 нмдля расчета дисперсион-ных сил, а также для определения списков соседей для каждого атома и переключениямежду прямым и обратным пространством для расчетов PME.

Все расчеты проводились впериодических граничных условиях с явным растворителем (использовалась модель водыTIP3P [242]).В качестве противоионов для нейтрализации отрицательного заряда в моделях липидныхбислоев (раздел 1.3.3) и ЛПС-мембран (раздел 1.3.5) нами были использованы ионы натрия.Важно отметить, что в реальных мембранах заряды ЛПС нейтрализуются, в основном, катионами Ca2+ . Кальций влияет на межмолекулярное взаимодействие ЛПС какin vitroin vivo,так и[22, 211]. Мы использовали ионы натрия вместо кальция, чтобы увеличить подвиж-ность системы и быстрее привести ее к равновесному состоянию.1.3.1Молекулы дисахаридовСвободная энергия конформаций дисахаридовLRha и�-DGal-(1→2)-�-DMan, �-DMan-(1→4)-�-�-LRha-(1→3)-�-DGal была вычислена с использованием метода расчета потенциаласредней силы (см.

раздел 1.4.2). Молекулу дисахарида помещали в центр кубического бокса,с размерами6 × 6 × 6 нм. Расчеты проводили в вакууме, при температуре 500 K в течение покрайней мере1 мкс.Чтобы получить достаточную статистическую информацию для мало-населенных областей конформационного пространства, мы сохраняли атомные координатына каждом шаге расчета (2 фс). Полученные карты распределения свободной энергии былипостроены для5 · 108реализаций, что позволило достичь ненулевой заселенности состоянийс относительными значениями свободной энергии до∼ 40 кДж/моль.Сходимость значенийсвободной энергии была подтверждена сравнением распределений свободной энергии, рассчитанных для всей траектории, с распределениями, полученными для ее частей.41Расчеты свободной энергии конформаций дисахаридов в водном окружении были выполнены в боксах такого же размера, но при более низкой температуре вдлиной100 нс300 K.Траекториибыли использованы для оценки влияния растворителя и низкой температурына структуру бассейнов глобальных минимумов.1.3.2Свободный О-антигенМД расчеты динамики молекулы О-антигена в растворе были проведены в додекаэдрическом боксе с расстоянием между параллельными гранями равным12 нм.Размер бокса былвыбран достаточно большим, чтобы избежать взаимодействия цепи самой с собой через периодические граничные условия.

Мы использовалилита. Общий размер системы составил около975атомов). Каждые50.1 М NaCl в качестве фонового электро-153000атомов (цепочка О-антигена содержалашагов моделирования мы вычитали координаты центров масс дляО-антигена и раствора.Для каждой из моделей цепочки О-антигена (OPLS-AA и GLYCAM) было проведено потри расчета молекулярной динамики длиной400 нспри температурерасчету предшествовал уравновешивающий расчет длиной300и500 К.Каждому10 нс, проведенный с использова-нием алгоритма Берендсена [243] для термо- и баростатирования. Затем финальные координаты этих расчетов были использованы в качестве стартовых для финальных расчетов,с использованием термостата Нозе-Гувера [238] и баростата Парринелло-Рамана [239].

Шагинтегрирования во всех расчетах составлял2 фс,длины связей между атомами водородаи тяжелыми атомами были фиксированы (алгоритм LINCS [240]). Частота записи координат атомов в финальных расчетах составляла2 · 1071.3.320 пс,что позволило нам проанализироватьсостояний О-антигенной цепи.Липидные бислоиМодели фрагментов липидных бислоев были собраны с использование онлайн утилитыcharmm-gui membrane builderлибо128[244]. Количество молекул липидов в бислое составляло50,штук. Начальные уравновешивающие расчеты были проведены при термостати-ровании и баростатировании по методу Берендсена [243] в течениепроведены250 нс200 нс,после чего былирасчеты с использование финального протокола (термостат Нозе-Гувераи баростат Парринелло-Рамана).

Структура мембраны считалась уравновешенной, если ееплощадь сохранялась постоянной в течение50 нс.421.3.4Моделирование ЛПС-мицелл12Мы разработалимоделей ЛПС-мицелл. Рассмотренные мицеллы состояли из4, 6, 8и14молекул Re-, Ra- и O3-LPS (S-LPS, содержащих 3 повторяющихся звена О-антигенной цепи).Сборка начальных состояний для расчетов была проведена следующим образом: мы ориентировали молекулы ЛПС вдоль нормалей к граням тетраэдра (для модели из4молекул),вдоль диагоналей октаэдра (для модели6 молекул), диагоналей куба (для 8 молекул), и диа-гоналей и нормалей к граням куба (для14 молекул).

После оптимизации геометрии системыдля каждой структуры были проведены10 нс релаксационные МД расчеты аналогично тому,как это было сделано для других систем (разделы 1.3.1, 1.3.2). Финальные расчеты проводились в течение500 нсв0.1 Мрастворе NaCl при комнатной температуре (300 K). Расчетплощади гидрофобной области ЛПС, экспонированной в раствор, был проведен с использованием утилитыgmx sasaиз пакета программ GROMACS, которая осуществляет “обкатку”поверхности выбранной группы атомов [245].1.3.5Моделирование ЛПС-мембранВ работе были построены модели трех симметричных Re-LPS-мембран, состоящих из:1. Re-LPS, не имеющей в своем составе Ara4N;2.

Re-LPS, имеющих один остаток Ara4N, присоединенный к остатку фосфорной кислотына проксимальном остатке глюкозы в составе липида A;3. Re-LPS, имеющих два остатка Ara4N, присоединенных к остаткам фосфорной кислотына обоих остатках глюкозы в составе липида A.Пространственная структура молекул Re-LPS была вытянута вдоль нормали к бислою спомощью утилитыsculptingв пакете PyMOL [246].

Молекулы в такой конформации бы-ли использованы для сборки стартовой структуры фрагментов Re-LPS мембран с помощьюутилитыmemgen,разработанной в ранее в нашей группе [247] и доступной на по на сайте:http://erg.biophys.msu.ru/wordpress/archives/272. Молекулы липидов были размещены в узлах гексагональной решетки с расстоянием между центрами равнымсистем составлял161 нм.

Размер каждой измолекул ЛПС на один монослой (начальный размер систем составлял6.0 × 5.0 × 7.5 нм) и 9 молекул на монослой (начальный размер — 4.5 × 4.0 × 7.5 нм). Оптимизация геометрии модельных систем выполнялась с помощью пакета GROMACS, последовательно применяя следующие интеграторы: градиентный спуск (steep), метод сопряженных43градиентов (cg) и метод l-bfgs. После оптимизации геометрии для каждой из систем были проведены 10 нс уравновешивающие расчеты с грубыми термо- и баростатом, а затем500 нс релаксационные расчеты расчеты в NPT ансамбле с точными термо- и баростатом,при температуре 300 K.Модель бислоя, состоящего из Re-LPS первого типа, была далее использована для сборки двух моделей S-LPS мембран.

Первая модель представляла собой чистый ЛПС бислой,содержащий 16 Ra-LPS в одном монослое и 8 Ra-LPS + 8 O12-LPS во втором монослое. Вторая модель представляла собой бислой Ra-LPS/O12-LPS со встроенными молекулами белкаOmpA [248]: финальная система состояла из 20 O12-LPS, 20 Ra-LPS и 8 OmpA � -бочонков.Стандартные утилиты, такие как charmm-gui [249] или мембранный плагин VMD [250], неподходят для работы с такими системами из-за большого количества белка по отношениюк липидной части и большого размера липидов.

Поэтому все атомные манипуляции выполнялись вручную с использованием пакета PyMOL и дополнительных программ на языкеPython.Создание моделей S-LPS мембран велось поэтапно. Сначала нами были созданы и уравновешены модели фрагментов Ra-LPS мембран размером 16 молекул на монослой для безбелковой системы и 9 молекул на монослой для модели с белком, путем добавления центральногоолигосахарида к каждой молекуле модельного бислоя Re-LPS первого типа (PyMOL). После200 нс расчетов в NVT ансамбле в водном растворе NaCl (0.1 M) обе модели Ra-LPS бислоевбыли уравновешены в течение 200 нс в ансамбле NPT в таком же окружении.