Отзыв официального оппонента Варижук А.М. (Разработка и применение методов ПЦР и ИФА для анализа остаточных ДНК и белков штаммов-продуцентов в биофармацевтических субстанциях)

ОТЗЫВ Официального оппонента Варижук Анны Михайловны на диссертационную работу Ковалевой Екатерины Викторовны «Разработка и применение методов ПЦР п ИФА для анализа остаточной ДНК н белков штаммов-продуцентов в биофармацевтическнх субстанцияхв, представленную па соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионаиотехнологии) В настоящее время одним нз важнейших вопросов современной технологии лекарственных средств является контроль качества производимых фармацевтических препаратов, активной субстанцией которых являются генно-инженерные белки. Актуальность темы диссертационной работы Ковалевой Е.В.

не вызывает сомнений, так как в данной работе речь идет о совершенствовании методов контроля качества препарата "'Онкогист'", предназначенного для терапии неходжкинских лимфом (действующее вещество — рекомбинантный гистон Н1.3 человека) и генно-инженерного инсулина человека. Однако стоит отметить, что предложенные Ковалевой Е.В.

подходы могут найти применение и на других аналогичных производствах. Технология получения рекомбинантых белков в любом случае предполагает возможносль наличия в конечной субстанции остаточных белков и ДНК продуцента. Методы ПЦР и ИФА позволяют отслеживать примеси гакого рода, однако оптимизация схемы проведения анализа представляет собой отдельную задачу в каждом конкретном случае. В представленной диссертационной работе зта задача успешно решена на примере двух актцвных фармацевтических субстанций, Степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций. Выносимые на защиту основные научные положении, выводы и рекомендации полностью обвснованьь Ковалевой Г.В. отработан метод определения остаточной ДНК штамма-продуцента в двух активных фармацевтических субстанциях: геино-инженерном инсулине человека и генно-инженерном гистоне Н1.3 человека.

При этом за основу были взяты известные подходы и методы ПЦР в реальном времени грвПЦР), а ключевой модификацией. ~пред~лившей значительную научную новизну рабать~, стало создание праймеров к генам 163-РНК как альтернативы входящим в состав коммерчески доступных наборов праймерам к плазмидной ДНК. Целесообразность данной модификации убедительно доказана диссертантом и подтверждена экспериментальными данными, на основании которых было проведено сравнение чувствительности рвПЦР с использованием коммерческих наборов и новых праймеров. Действительно, геномная ДНК, как правило„превалирует над плазмидной в составе тотальной остаточной ДНК штамма-продуцента, и ее количественное определение имеет первостепенное значение.

Кроме того, наличие в составе бактериального генома множества копий генов 163-РНК позволяет снизить предел дете кции. Предложенная диссертантом модификация потребовала депо«о оптимизации схемы проведения анализа и условий реакции. В часпюсти, было проведено сравнение эффективности и чувствительности рвПЦР с использованием интеркалнрующего красителя БУВВ. ОКЕЕХ 1 и Тж1Мап-проб. При прочих равных показателях, предпочтение обычно отдают первому методу из экономических соображений. Действительно, в результате всестороннего исследования диссертантом было установлено, что применение БУБА (ЖЕЕ1ч 1 н ТацМап-проб дает сопоставимые результаты в данном случае, и выбор сделан в пользу ЗУБАМ ОКЕЕ1ч 1.

Вторым существенным аспектом контроля качества генно-инженерного инсулина, рассмотренным в диссертационной работе, стала проверка валидационных характеристик метода ИФА с применением коммерчески-доступных наборов для количественного определения проинсулина на предмет соответствия критерию приемлемости прн анализе активной фармацевтической субстанции. Показано, что наборы «Рго1пзп11п И.1ЯАв, предназначенные изначально для анализа плазмы крови, удовлетворяет таким критериям. Хотя эту часть рабагы нельзя расценивать как инновационную, она имеет больпгае практическое значение.

Полученные Ковалевой Е.В. результаты и сделанные выводы легли в основу нормативной документации для Опытного биотехнологического производства ИБХ РАН. Диссертация Ковалевой Е.В. построена традиционно и состоит нз введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов н списка пнтнруемой литературы, включающего 106 источников.

Работа изложена на 128 страницах, содержит 59 рисунков н 17 таблиц. Диссертацпя написана в целом грамотно„ результаты изложены четко, последовательно н логично, все выводы подкреплены экспериментальными данными. Автореферат и опубликованные работы в полной мере отражают содержание диссертации. По тексту работы можно сделать несколько замечаний, которые, тем не менее, не влияют на общую положительную оценку: - Механизм действия препарата "Онкогист", активной субстанцией которого является гистон Н1,3, описан в литературном обзоре несколько поверхноспю.

Ссылки на ключевые источники (например, патент Огозз е1 а1. 0 Ратеп1 138 20110034370 А1. 2008) отсугствуют. Единственная приведенная ссылка по данному препарату — на тезисы 2010 года. В диссертации указано, что гистон взаимодействует с отрицательно заряженными фосфолипидами, в частности фосфадилсерином, который в норме является компонентом внутреннего слоя мембраны.

на обнаруживается в значительных количествах на поверхности мембран онкоклеток. Такие взаимодействия приводят к встраиванию гисгона в мембрану, образованию дефектов 1каналов), нарушению ионного обмена, н в конечном итоге — клеточной гибели. В диссертации не упоминается второй предполагаемый механизм, о котором сообщается, в частности, в докладах одного из производителей препарата - компании *'БутпЬюгес". Второй механизм опосредован связыванием гистона Н13 с другими компонентами хроматина (гистонами Н2А, Н2В, НЗ и Н4), экспонированными на поверхности некоторых линий онкоклеток и отсутствующими в мембранах нормальных клеток, что индуцирует образование крупных гистоновых агрегатов в мембране и ее дальнейшее повреждение.

- В диссертации встречаются не совсем удачные, на мой взгляд, формулировки (" активная субста~щия - аналог Ругнкснмаба"; '"блокировка аминогруппы протоном"; *'Ы-концы гистонов выступают из ядра" — подразумевалось, очевидно, ядро нуклеосомы). - Оценку диапазона длин фрагментов остаточной ДНК в фармацевтических субстанциях методом электрофоратического анализа после радиоактивного мечення 1Рз ), на мой взгляд, резонно было бы провести до дизайна праймеров.

Это позволило бы своевременно установить нецелесообразность использования праймеров к ампликону длиной 425 п.о., что значительно превышает среднюю длину фрагментов остаточной ДНК продуцента. - В названии диссертации фигурируют "остагочная ДНК и белки штамма-продуцента'". Проинсулин, содержание которого в генно-инженерном инсулине контролировалось методом ИФА, нельзя, строго говоря, отнести к белкам продуцента. Вероятно, формулировка "белки н остаточная ДНК продуцента'" была бы более корректна Подводя итог, хотелось бы отмстить, что„несмотря на приведенные выше замечании и спорные моменты, диссертационная рабггга Ковалевой Е.В. является, по моему мнению, прекрасно спланированным, законченным н цельным научным исследованием, выполненным на высоком техническом уровне с применением современных методов.

Диссертация «Разработка и применение методов ПЦР и ИФА для анализа остаточной ДНК и белков штаммов-продуцентов в биофармацевтических субстанциях» полностью соответствует п. 9 «Положения о порядке присуждения ученых степеней»„ поскольку в ией описаны новые научно обоснованные результаты, технологическое внедрение которых имеет важное значение для методов контроля качества АФС разрабатываемых препаратов для лечения неходжкинских лимфом и сахарного диабета.

Все поставленные диссертантом задачи успешно выполнены, заявленная цель достигнута. Ковалева Е.В., несомненно, заслуживает присуждения ученой степени кандидата химических наук по специальности 03.01,06 — Биотехнология !в том числе бионанотехнологии). Варижук Анна Михайловна кандидат химических наук по специальности 03.01.03 — Молекулярная биология старший научный сотрудник лаборатории искусственного антителогенеза ФГБУ Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины ФМБА Дата: 21 ноября 2016 г. Ученый секретарь, к.б.н. Васильева Лю медицины ФМБА ФГБУ Федеральный научно-клиннческ Адрес: 119435, Российская Федерация, г. Москва„ул. Малая Пироговская, д.! а тел.:+7 (4991 246-4409 Е-ша!1: 1п1о®гсрсш.огй Публикации официального оппонента, кандндкга химических наук, Варижук Анны Михайловны 1ФГБУ Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА) 1.

ВагуИпа ХУ, БиЬасЬ ОМ, Оогошп 0А, Богяйоь УР, КояЬсЫпа МА, Кип!!аула ТА„ Ма1уаЬеч АУ, Бшшиж 1У, Ах!еаза АМ, Бойе!а 1Б, Р!аг!гех1сЬ КО„Виггаес МБ, Ъ'апхЬи!г АМ, Рохшойоъа бЕ, АпоИип КУ, БиЬасЬ РЧ, Епйо!ороси бХ. А пею г!ев!8п 1ог а йгееп са1сипп нийсагог ич!Ь а япа11ег мхе аиг! а гег!исед пшпЬег ог са!с!иш-Ь!пош8 ягеа.// БИ Кер. 2016 Бер 28;6:34447. оой 10.1038/агер34447. 2.