Отзыв ведущей организации (Разработка и применение методов ПЦР и ИФА для анализа остаточных ДНК и белков штаммов-продуцентов в биофармацевтических субстанциях)

ФАНО РОССИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ НОДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК 123т32 Москва, вв Акад И В Курчатова,а 2 Тел. (499Д 96-9996. Факс ~499П 96 022И Ечоаа аво~~фк»О таа Ра и м г На № Замест научно Инсти генети д.б.н, проф. П.А. Сломинский «23» ноября 2016 г. ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ на диссертационную работу Ковалевой Екатерины Викторовны «Разработка и применение методов ~ЦР и ИФА для анализа остаточной ДНК и белков штаммов-продуцентов в биофармацевтических субстанциях», представленную на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертантом Ковалевой Е.В.

была успешно выполнена научно-квалификационная работа, тема которой в настоящее время является крайне актуальной, поскольку обусловлена необходимостью разработки чувствительных и специфичных методов по определению остаточной ДНК и белков штаммов-продуцентов в активных фармацевтических субстанциях. Это особенно важно для жизненно необходимых лекарственных препаратов, применяемых у пациентов с сахарным диабетом, а также онкологическими заболеваниями.

Число пациентов с указанными видами заболеваний стремительно увеличивается с каждым годом. Инсулинотерапия осуществляется, как правило, пожизненно, а противораковые препараты вводят в виде инфузий в больших дозах пациентам с ослабленным иммунитетом. Поэтому значимым фактором является безопасность активных фармацевтических субстанций ~АФС), на основе которых производят готовые лекарственные формы.

Коммерческие наборы, в силу их универсальности и недостаточной чувствительности, целесообразно использовать лишь на первоначальной стадии разработки аналитической методики. В качестве объектов исследования выбраны активные фармацевтические субстанции штаммов-продуцентов й.сой — генно-инженерный инсулин человека, а также рекомбинантный гистон Н1.3 человека. Последний успешно применятся для химиотерапевтического лечения неходжки иск их лимфом, что является весьма перспективным направлением в противоопухолевой терапии, на фоне отсутствия иммуногенности, поскольку гистоны являются белками человеческого организма.

Содержание работы Во введении диссертант обосновывает выбор темы и ее актуальность, определяет цель и задачи работы, формулирует цель и задачи исследования, раскрывает научную новизну и практическую значимость диссертационной работы, указывает количество публикаций и апробаций по результатам исследований.

Предпосланный собственным результатам автора обзор литературы отличается полнотой и логичностью выбранных областей научных и практических знаний, непосредственно связан с темой исследования. Литературный обзор посвящен не только теоретическим основам методик, применяемых автором, но и вопросам технологии производства рекомбинантных ДНК, необходимости надлежащего выполнения требований отечественной и международной нормативной документации в области производства и контроля качества биофармацевтических препаратов. В начальных главах литературного обзора описано терапевтическое действие человеческих генно-инженерных инсулина и гистона Н1.3, перечень технологических операций при производстве исследуемых диссертантом активных фармацевтических субстанций, рассмотрены этапы контроля показателей качества получаемых АФС, изложены подходы к управлению рисками на биотехнологическом производстве, отмечена необходимость и основные принципы валидации аналитических методик контроля качества АФС.

В заключительных главах описаны типы ПЦР, а также основные подходы к применению метода ИФА. В целом, обзор литературы дает полное представление о современном состоянии вопроса и служит хорошим введением к изложению собственных результатов автора. Диссертантом были поставлены следующие задачи. Разработка метода ПЦР в реальном времени для определения остаточной ДНК штамма-продуцента Е. со11, на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого и генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого, с последующей оценкой использования интеркалирующего красителя ЯУВК ОКЕЙ 1 и технологии Таг1Мап, а также выбор оптимальной методики. Сопоставление показателей разработанной методики ПЦР в реальном времени и параметров коммерческого набора фирмы Сулла ТесЬпо1оя1ез по определению остаточной ДНК штамма- продуцента Е.сой в АФС генно-инженерного инсулина человека и генно-инженерного гистона Н1.3 человека. Оценка возможности успешного применения нестандартного набора для ИФА, предназначенного для обнаружения прони сулила в плазме крови, при определении проинсулина в АФС генно-инженерного инсулина человека, путем сравнения валидационных параметров двух исследуемых наборов.

Один из которых непосредственно разработан для выявления проинсулина в АФС инсулина, другой предназначен для обнаружения проинсулина в плазме крови. Применение разработанных методик в контроле качества при производстве рекомбинантных белков инсулина и гистона Н1.3 на Опытном биотехнологическом производстве ИБХ РАН.

В Экспериментальной части автором приведены объекты исследования и современные аналитические методы, используемые в диссертационной работе. Приведены программы для амплификации каждого из исследуемых ампликонов. Подробно и последовательно описаны ключевые методики по наращиванию биомассы, выделению тотальной и плазмидной ДНК, приготовлению раствора рабочего стандартного образца (РСО), пробоподготовке субстанций, подробно описаны методики ПЦР и ПЦР в реальном времени.

Все представленные данные получены Ковалевой Е.В. в результате корректно выполненных и подробно изложенных экспериментов. Часть «результаты и обсуждение» логично поделена на разделы, которые отражают последовательное выполнение обозначенных диссертантом задач. На первом этапе исследований по разработке метода ПЦР в реальном времени для определения остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС инсулина и гистона Н1.3 Ковалевой Е.В. был создан рабочий стандартный образец на основе различных подходов к фрагментации тотальной ДНК штамма-продуцента инсулина и гистона Н1.3, проведена оптимизация пробоподготовки исследуемых активных фармацевтических субстанций, которая показала необходимость введения стадии трипсинолиза для субстанции гистона Н1.3 до выделения остаточной ДНК из АФС.

Затем была проведена основательная работа по подбору компонентов и условий проведения ПЦР в реальном времени: разработаны праймеры к геномной ДНК Е.со!1, амплифицирующие фрагменты гена 163 РНК различной длины; проведена оптимизация по подбору компонентов и режиму проведения реакции. Для разработанных вариантов анализа построены калибровочные кривые с 6 параллельными определениями для каждого из калибровочных растворов РСО, установлена линейность и эффективность реакций. Максимальную эффективность при наименьшем пороговом цикле флуоресценции показали реакции, генерирующие ампликоны размером 425 п.о. и 179 п.о.

Затем при помощи праймеров к плазмидной и геномной ДНК штамма-продуцента инсулина было установлено, что количество геномной ДНК в АФС минимум на порядок превышает содержание плазмидной ДНК. Таким образом, диссертантом был сделан логичный вывод о том, что использование праймеров к геномной ДНК - фрагменту 1бЯ РНК Е.со11 позволяет значительно повысить чувствительность метода ПЦР для выявления остаточной ДНК в исследуемых АФС. На следующем этапе в рамках методики ТацМап ПЦР в реальном времени Ковалевой Е.В.

были разработаны и протестированы зонды к фрагменту гена 168 РНК Е.со11, с использованием различных флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции. В итоге был выбран зонд, обеспечивающий максимальную чувствительность и эффективность ПЦР реакции. Для корректного определения концентрации остаточной ДНК необходимо знать в каком виде остаточная ДНК штамма-продуцента Е.со11 представлена в АФС после прохождения продуктом всех стадий технологического процесса. С этой целью автор определил диапазон фрагментов остаточной ДНК в субстанции генно-инженерного инсулина человека при помощи электрофоретического разделения в ПААГ фрагментов остаточной ДНК, меченной фосфором Рз~.

Указанный диапазон составил 80-250 п.о. Соответственно, был сделан вывод о том, что для дальнейших исследований необходимо применять праймеры, размер ампликонов для которых попадает в указанный интервал. Задача была успешно решена в результате разработки праймеров к геномной ДНК штамма-продуцента, дающих ампликоны размером 100 п.о. и 198 п.о. Методика с амплификацией фрагмента 100 п.о. показала лучшую чувствительность, в сравнении с амплификацией фрагмента 198 п.о., как в формате постановки с ЯУВК ОКЕЕХ 1.

так и с ТацМап-зондом. Значения пороговых циклов флуоресценции для рассмотренных реакций были сопоставимы, но для рутинных исследований выбор был сделан в пользу методики рвПЦР с использованием ЯУВК ОБЕЕМ 1, по причине ее простоты и относительно меньшей стоимости. Далее диссертантом Ковалевой Е.В. проведено сопоставление показателей разработанной методики ПЦР в реальном времени (ЯУВК ПРЕЕМ 1) и параметров коммерческого набора фирмы Су8ппя ТесЬпо1о81ез при анализе остаточной ДНК штаммапродуцента инсулина и гистона Н1.3. В ходе исследования было показано, что разработанная автором система в 30 раз превышает по чувствительности коммерческую и может использоваться для анализа препаратов с низким содержанием остаточной ДНК, что не позволяет сделать коммерческий. При этом разработанный метод дешевле коммерческого набора.

На завершающем этапе исследований автором было проведено сравнение валидационных характеристик метода ИФА для определения проинсулина в генно-инженерной субстанции с использованием коммерческих наборов «Пан креоИ ФА-прои нсулин» (ЗАО «АлкорБио», Россия) и «Ргошзп11п ЕЫЯА» (1ЖО 1пзгпппептя ОтЬН, Германия). Оценка ряда параметров на соответствие критериям приемлемости позволил сделать вывод о том, что набор «Ргошзп1т ЕЫЯА» обладает большей чувствительностью при определении проинсулина на фоне присутствия больших количеств инсулина, что позволяет рекомендовать его для анализа производственных фармакологических субстанций. Научная новизна приведенных исследований и полученных результатов заключается в следующем Ковалевой Е.В.

разработанны праймеры и зонд к фрагменту гена 168 РНК Е.сой, которые позволяют увеличить чувствительность метода определения остаточной ДНК штаммапродуцента в фармацевтических препаратах генно-инженерного человеческого инсулина и гистона Н!.3 в 30 раз. Это дает возможность производителям, использующим разработанную диссертантом технологию, существенно повысить контроль за уровнем остаточной ДНК и гарантировать более высокое качество АФС.