Свободное окисление протекает при участии свободнорадикальных форм кислорода, которые образуются в процессе одноэлектронного восстановления кислорода и прежде всего супероксид-аниона кислорода.

Обычно эти реакции свободнорадикального окисления протекают в активном центре соответствующих ферментов, а промежуточные продукты не появляются во внешней среде. При изменении условий функционирования дыхательной цепи (например, при гипоксии) в ней также возможно одно-электронное восстановление кислорода, объясняющееся тем, что его сродство к убихинону выше, чем к цитохромоксидазе. Эти процессы приводят к образованию супероксид-аниона кислорода. Этот радикал может образовываться и под влиянием ультрафиолетовых лучей, а также путем взаимодействия кислорода с ионами металлов переменной валентности (чаще всего с железом) или в ходе спонтанного окисления некоторых соединений, например дофамина. Наконец, он может продуцироваться в клетках и такими ферментами, как ксантиноксидаза или НАДФН-оксидаза.

Образование супероксид-аниона кислорода имеет важное биологическое значение. Он является высокореакционным соединением, которое вследствие высокой гидрофильности не может покидать клетку и накапливается в цитоплазме. Его превращения приводят к образованию ряда активных окислителей (рис. 9.10). Он способен активировать NO-синтазу, которая образует в тканях NO-радикал, обладающий свойствами вторичного посредника (активирует растворимую гуанилатциклазу, продукт которой – цГМФ – проявляет вазодилататорные свойства). С другой стороны, супероксид-анион способен снижать содержание NO-радикала, превращая его в пероксинитрит ONOOH (см. рис. 9.10).

Живые клетки имеют системы защиты от повышенной продукции свободных радикалов. Ферментсупероксиддисмутаза превращает супероксид-анион кислорода в менее реакционноспособный и более гидрофобный пероксид водорода Н2О2. Пероксид водорода является субстратом каталазы и глутатионзависимых пероксидаз, которые катализируют его превращение в молекулу воды. Однако пероксид водорода может генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа или превращаться в гипохлорит-анион ОСl–ферментом миелопероксидазой.

Рис. 9.10. Взаимопревращения свободных радикалов и их основные функции в тканях [Болдырев А.А., 1996].

Как гипохлорит-анион, так и гидроксил-радикал являются сильными окислителями. Они способны модифицировать белки, нуклеиновые кислоты, индуцировать перекисное окисление липидов (от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные мембранные липиды) и в результате цепных реакций приводить к множественным нарушениям мембран и к гибели клеток. Важным дополнением этих реакций является способность NO-радикала при взаимодействии с супероксид-анионом образовывать пероксинитрит, который может индуцировать так называемый апоптоз (запрограммированная гибель клеток), а в ходе своего спонтанного распада превращаться в гидроксил-радикал. Последний может образовываться также из гипохлорит-аниона в присутствии ионов железа.

Процессы, протекающие до момента образования гипохлорит-аниона или гидроксил-радикала, локализованы в цитоплазме и контролируются цитоплазматическими ферментами или природными водорастворимыми антиоксидантами. Например, таурин способен связывать гипохлорит-анион в форме хлораминового комплекса, дипептид карнозин и его производные нейтрализуют гидроксил-радикал, а такие соединения, как белок ферритин, связывают железо. Перекисное окисление липидов, инициируемое в гидрофобном пространстве клеточных мембран, способен прерывать широко известный гидрофобный антиоксидант α-токоферол (витамин Е). Его высокая концентрация в биологических мембранах препятствует их повреждению свободными радикалами.

Полное подавление перекисных процессов в тканях, по-видимому, нецелесообразно, свободные радикалы обладают полезными свойствами. Они индуцируют апоптоз, участвуют в формировании клеточного иммунитета. Образование гидроперекисей жирнокислотных цепей полиненасыщенных фосфолипидов повреждает бислой и, стимулируя работуфосфолипаз, способствует высвобождению жирных кислот из состава мембранных липидов. Полиненасыщенная арахидоновая кислота является обычной мишенью для свободнорадикальной атаки. Этот процесс может стимулировать ферментативные превращения ее по одному из двух путей – липоксигеназному или циклооксигеназному. В результате в клетке образуются важные биологические регуляторы: простагландины,лейкотриены, тромбоксаны. Лизофос-фолипиды, образующиеся при отщеплении модифицированной жирной кислоты, могут быть восстановлены до исходного состояния с использованием другой жирной кислоты (в форме ацил-КоА). Таким образом может регулироваться жирнокислотный состав липидных молекул в клеточной мембране.

Высокореакционные свободные радикалы кислорода, характеризующиеся высоким окислительным потенциалом и способностью к быстрым превращениям, могут индуцировать цепные реакции. В настоящее время признается важная роль свободнорадикальных процессов в развитии возрастных и патологических состояний в тканях[Владимиров Ю.А. и др., 1983]. Свободнорадикальные превращения вовлекаются в механизмы, повышающие выживаемость клеток в неблагоприятных условиях, а снижение генерации свободных радикалов в организме способствует ослаблению клеточного иммунитета. Однако усиленная генерация свободных радикалов сопровождает патологические состояния (болезнь Паркинсона, Альцгеймера) и сам процесс биологического старения.

У растений при любом виде стресса наблюдается увеличение уровня ФАК, в том числе супероксидрадикала. Например,при развитии окислительного стресса перекись и супероксидрадикал выступают активаторами экспрессии генов альтернативной оксидазы, которая препятствует распространению стресса. При подавлении цитохромного дыхания это позволяет не обрывать цепь на втором комплексе, а сбрасывать е на АО.

Билет 8.

Типы объемных взаимодействий в макромолекулах. Физические характеристики объемных взаимодействий.

Типы объемных взаимодействий. Первичная структура полимерной цепи определяется химическими или валентными взаимодействиями. Объемные взаимодействия в основном определяют вторичную структуру макромолекул. Общим критерием стабильности молекулярной структуры является наличие минимума на кривой U(r) зависимости энергии взаимодействия от расстояния между взаимодействующими частями. Картинка «Электронный терм для двухатомной молекулы».

На малых расстояниях преобладают силы отталкивания, а на больших расстояниях превалирует притяжение. При r = r_o силы притяжения и отталкивания уравновешивают друг друга. Значение энергии U(r) свободных частиц при r -> к бесконечности равно нулю, а энергия образованной ими стабильной структуры отрицательна U(r_o) < 0. На малых расстояниях, где частицы отталкиваются, U(r) > 0. Минимум U(r₀) соответствует максимальной по абсолютной величине и отрицательной по знаку энергии взаимодействия. В образовании вторичной структуры белка играют большую роль силы Ван-дер-Ваальса. Они имеют электромагнитную природу и связаны с взаимодействием электрических диполей в соседних молекулах. Наиболее распространены дисперсионные взаимодействия между молекулами, которые не обладают постоянными дипольными моментами. Природа этих сил носит квантовомеханический характер.

Неопределенности в значениях координаты дельта х и импульса дельта р связаны соотношением неопределенностей

дельта х дельта р = h​

Это значит, что и в основном невозбужденном состоянии существуют быстрые смещения заряда электрона от положения равновесия, а следовательно, в молекуле в состоянии покоя появляются "мгновенные" дипольные моменты. Появление такого момента в одной молекуле индуцирует появление его в соседней молекуле. Возникает взаимодействие двух быстроменяющихся дипольных моментов, которые, таким образом, становятся связанными и притягиваются друг к другу. Энергия притяжения двух мгновенных диполей, или энергия дисперсионного взаимодействия, быстро убывает с расстоянием U_дисп~1/r⁶.

Кроме дисперсионного взаимодействия возможно и электростатическое притяжение между постоянными диполями в полярных молекулах. Кроме того, существуют также индукционные взаимодействия, которые возникают между постоянным дипольным моментом в одной молекуле и наведенным им диполем в соседней поляризуемой молекуле. Суммарное ван-дерваальсово взаимодействие двух молекул зависит от вклада всех типов дипольных взаимодействий и составляет по величине от 1,0 до нескольких десятков ккал/моль.

В выражении для полной энергии или полного потенциала взаимодействия необходимо учесть не только притяжение U_притяж(r)~1/r⁶, но и отталкивание на близких расстояниях U_отт(r)~1/r¹²) сложение этих величин дает формулу на картинке ,

где А и В - константы притяжения и отталкивания, r,_k - расстояние между взаимодействующими атомами (i и k).

Наряду с силами Ван-дер-Ваальса большую роль в стабилизации биоструктур играют водородные связи и электростатические взаимодействия между заряженными и полярными группами. Водородные связи, например, стабилизируют вторичную структуру полипептидных цепей. В энергию водородной связи дают вклад электростатические взаимодействия, притяжение и отталкивание, а также энергия делокализации электронов. Величины энергии водородной связи сильно варьируют (3 - 8 ккал/моль). Так, водородная связь

О-Н ... О обладает энергией 8,6 ккал/моль.

Электростатические взаимодействия задаются формулой ,

где q_i, q_k - заряды на атомах (i и k), r_ik - расстояние между атомами, эйпсилон - диэлектрическая постоянная.

Условия существования клубка и глобулы. Вследствие объемных взаимодействий сблизившиеся участки могут либо притягиваться, либо отталкиваться друг от друга. Повышение температуры приводит к увеличению отталкивания между мономерами, понижение — способствует их взаимному притяжению. Существует температура, при которой отталкивание мономеров полностью компенсируется их взаимным притяжением. Эта температурная точка называется тета-точкой или тета-температурой. В тета-точке объемные взаимодействия отсутствуют, и макромолекула представляет собой клубок с размерами R ~ lN^1/2, который сохраняется и при повышении температуры Т > тета. Однако в области Т > тета из-за увеличения сил отталкивания размеры клубка возрастают: R > lN¹/². где а — коэффициент набухания макромолекулы; а > 1 в области Т > тета и а = 1 при Т = тета.

В хороших растворителях притяжение атомов цепи и растворителя больше, чем между атомами цепи, что равносильно увеличению их взаимного отталкивания в таком растворителе (область Т > тета; здесь а > 1). Наоборот, в плохих растворителях взаимное притяжение звеньев полимера больше, чем их притяжение к молекулам растворителя (область Т < тета; а < 1). В области Т < тета в объемном взаимодействии превалируют силы притяжения, которые могут привести к конденсации полимерного клубка в плотную слабо флуктуирующую глобулу. Эта глобула стабилизируется самосогласованным сжимающим полем, обусловленным силами притяжения между мономерами.

Общая топография белковой глобулы определяется тем, что полярные группы расположены в основном на поверхности, а неполярные находятся внутри глобулы и образуют ее гидрофобное ядро. На поверхностях основных элементов вторичной структуры альфа - спиралей и бета - структур также имеются целые гидрофобные области. Внутримолекуярные водородные связи между пептидными группами максимально насыщены и стабилизируют глобулу.

Картинка 2. На ранних стадияхсворачивания в развернутой цепи образуются альфа - или бета - участки вторичной структуры за счет локальных взаимодействий. Затем эти участки стабилизируются в результате действия гидрофобных сил, водородных связей и объемных взаимодействий с другими участками цепи с образованием уже третичной структуры. Самосборка структуры белка носит направленный кооперативный характер. Она протекает через определенное число промежуточных стадий, а не путем перебора всех возможных вариантов укладки до достижения минимального по энергии состояния.Реальное время сворачивания белковой глобулы - несколько секунд.

Выгодные низкоэнергетические состояния появляются сразу на ранних этапах сворачивания в небольших участках цепи, включающих два - три остатка. Вначале для расчета низкоэнергетической конформации белка находят низкоэнергетические состояния дипептидов. Низкоэнергетические формы трипептидов представляют собой комбинации низкоэнергетических форм смежных дипептидов, что является результатом согласованности три - и дипептидных взаимодействий. Конформационный анализ более сложных олигопептидов проводится методом последовательного увеличения цепи на один остаток. Важно, что новые взаимодействия, возникающие при удлинении цепи, стабилизируют фрагмент и не нарушают уже сложившихся взаимодействий и низкоэнергетических форм. В настоящее время такой полуэмпирический метод расчета дает возможность определить пространственную структуру достаточно сложных полипептидов, включающих до сотни остатков.

Особенности пространственной организации нуклеиновых ки­слот. Структура ДНК более стабильна. Тепловые флуктуации не приводят к разрыву водородных связей и не меняют меж­плоскостные расстояния между основаниями. В моделях жесткость слу­жит основным параметром. Двойная спираль ДНК обладает общей жесткостью по длине спирали и одновременно ограниченным числом вращательных степеней свободы вокруг единичных химических связей. Все конформации ДНК относятся либо к А- , либо к В - формам. В слу­чае В - форм ось спирали проходит через пары оснований вблизи их центра тяжести, а в А - форме в центре остается отверстие около 4 Е, а основания оттеснены к периферии молекулы. Конформация мономера нуклеиновой кислоты задается конформацией сахарного кольца, пятью двугранными углами вращения вокруг единичных связей в сахарофосфатной цепи и одним углом х, опреде­ляющим ориентацию основания относительно сахарного кольца. Разли­чие А - и В - форм состоит в том, что у А - формы отличаются значения угла х и угла поворота т(тау) между соседними парами, а также большие зна­чения расстояния D пары от оси спирали. Картинка 3.

Кроме того, альтер­нативная геометрия сахарного кольца у А - и В - форм определяется тем, какой из атомов углерода выдвинут из плоскости сахарного кольца. Наличие столь большого числа внутренних степеней свободы позволяет рассматривать процесс изменения конформации двойной спирали как непрерывный. Но для регулярной спирали существует только ограниченное число конформаций сахарофосфатного остова. Энергия А - форм в целом выше, а ширина энергетической ямы уже, чем у В - форм. Это является следствием того, что расстояние между одноименно заряженными фос­фатами одной и той же цепи примерно на 1Е короче в А - формах. Пол­ный учет всех взаимодействий показывает, что В - форма является единственной устойчивой формой ДНК.

В последние годы получены данные о существовании так называе­мой z - формы ДНК, в которой спираль с антипараллельными нитями закручена влево, а повторяющаяся единица содержит не один, а два нуклеотида.

Механизмы защиты от форм активированного кислорода в клетке. Ферментные системы, антиоксиданты и каротиноиды.

Существует несколько типов защитных механизмов от АФК :