При количественном спектрофотометрическом анализе главная задача исследователя – измерить концентрации, а значит, и оптические плотности растворов с наибольшей возможной точностью. Можно показать, что наименьшая погрешность в определении концентрации получается при оптической плотности раствора от 0,2 до 0.8.

Есть несколько способов, позволяющих добиться максимальной точности спектрофотометрического анализа: а) разбавление слишком концентрированного раствора или б) уменьшение толщины образца; в) подбор длины волны, при которой обеспечивается попадание измеряемых величин оптической плотности в оптимальные пределы.

Повреждающее и регуляторное действие света видимого диапазона. Сенсибилизаторы.

Любой фоторегуляторный процесс включает несколько последовательных стадий:

1)поглощение кванта света и образование возбуждённого состояния фоторецептора

2)фотофизическая реализация энергии возбуждения

3)Сенсибилизация фотохимической реакции

4)образование промежуточных продуктов

5)конечное проявление фотобиологических эффектов

Фотосенсибилизаторами называются вещества, выступающие в качестве первичных фоторецепторов в фотобиохимических реакциях.

Пигменты-сенсибилизаторы большинства фотобиологических процессов до сих пор не идентифицированы (о их природе можно судить только по спектрам действия фотобиологических эффектов). Исключением является пигмент фитохром. Это димер, каждый мономер которого содержит хромофор (фитохромобилин), присоединённый к апобелку тиоэфирной связью. Фитохром обладает фотоконверсией – под действием красного и дальнего красного света он способен менять свою конформацию с изменением максимума поглощения при 660нм (К) и 730 нм (ДК). Дальнекрасная форма фитохрома (Ф730) характеризуется наличием гидрофобной зоны, что позволяет фитохрому взаимодействовать с регуляторными и сигнальными молекулами.

Принцип действия фотосенсибилизаторов основан на эффективном изменении активности ферментов, а также проницаемости мембран, при поглощении кванта света. Поглощая свет, молекула сенсибилизатора претерпевает фотохимическую реакцию (например, цис-транс изомеризацию), приводящую к изменению пространственной конфигурации фотохрома, что отражается на характере взаимодействия фотохрома с ферментом.

Однако, не все фотосенсибилизаторы реагируют на красный свет . Пример процесса, индуцируемого синим светом, является фототропизм. Основными рецепторами этих реакций являются флавиновые хромофоры. (за счёт фотосенсибилизированных рибофлавином окислительных реакций происходит активация транспорта ауксинов через мембрану). Ещё к реакциям, которые индуцируются синим светом, относятся каротиногенез, фототаксис.

Фотодинамическими называются фотосенсибилизированные деструктивные процессы в большинстве случаев протекающие с участием кислорода. Фотодинамические реакции разделяются на 2 типа, в зависимости от того, каким способом энергия светового возбуждения передаётся на биологический субстрат.

В реакциях I типа возбуждённый сенсибилизатор может осуществлять ОВР с различными молекулами (перенося либо электрон, либо атом водорода). В результате образуются реакционноспособные радикалы сенсибилизатора и субстрата, в

ступающие в химические реакции с кислородом.

В реакциях II типа перенос энергии от возбуждённой в триплетном состоянии молекулы сенсибилизатора происходит к кислороду с образованием синглетной формы кислорода, который окисляет молекулы биологического субстрата.

Однако существую фотодинамические реакции, не требующие участия кислорода. В частности, такие процессы протекают в ДНК. Энергия возбуждения в данном случае передаётся с молекул-сенсибилизаторов на азотистые основания, вызывая их димеризацию (это происходит под действием УФ излучения).Интересно, что данное действие является фотообратимым.

Под действием УФ протекает реакция фотогидратации ДНК, когда к пиримидиновому кольцу присоединяется молекула воды. Однако, это реакция протекает только в одноцепочечных НК, что имеет большое значение для процессов Репликации и транскрипции.

УФ может вызывать появление пиримидовых аддуктов (аддукт – это 2 соединённых пиримидоных основания). Эта реакция имеет значение в качестве способа появления мутаций.

Все вышеприведённые реакции соответствовали коротковолновому УФ излучению.

Теперь рассмотрим реакции, которые вызывает длинноволновое УФ излучение. Данный свет индуцирует в ДНК образование пиримидиновых димеров и одноцепочечные разрывы. Очевидно, что молекула ДНК не может служить первичным хромофором при действии УФ излучения (300-320 нм). Следовательно, и димеры, и разрывы должны образовываться не за счёт прямого поглощения квантов молекулой ДНК, а косвенным путём с участием определённых молекул – хромофором, тесно связанных с ДНК. Зависимость от молекулярного кислорода позволяет считать, что образование этих фотопродуктов идёт по фотодинамическому механизму. Такой механизм осуществляется при наличии следующей комбинации факторов: свет+хромофор+О₂ . Как и любая фотохимическая реакция, фотосенсибилизированный процесс имеет начальную «световую стадию» и последующие «темновые стадии». Наиболее характерные первичные реакции заключаются либо в переносе электрона (или атома водорода), либо в переносе энергии (или электрона) на кислород.

При фотосенсибилизированном образовании кислородо-зависимых одноцепочечных разрывов в ДНК в качестве эндогенных сенсибилизаторов выступают НАДН, 4-тиоуридин и 2-тиоурацил. Установлено, что фотосенсибилизированная этими соединениями инициация разрывов в ДНК осуществляется по фотодинамическому механизму с участием АФК. При этом первичной фотогенерируемой формой кислорода является супероксидный анион-радикал. Однако он обладает малой реакционной способностью по сравнению с радикалом ОН*. Соответственно, фотодинамическую реакцию одноцепочечного разрыва ДНК можно представить как : S à S* à S⁺ + О’₂^- à Н₂О₂ à OH’ à ДНК à одноцепочечный разрыв

Билет 14

Возбужденные состояния молекул. Схема Яблонского. Законы люминесценции.

Полная энергия молекулы состоит из электронной, колебательной и вращательной составляющих. Молекулы имеют заполненные и свободные электронные орбитали. Поглощение кванта света приводит к переходу электрона на незаполненную орбиталь с большей энергией, и молекула переходит на более высокий энергетический уровень (молекула в возбужденном состоянии), при этом увеличивается и электронная и колебательная составляющая общей энергии молекулы (рис.1).

Законы молекулярной люминесценции: правило Каши, закон Стокса—Ломмеля, правило Левшина, закон Вавилова.

Правило Каши касается формы спектров люминесценции при возбуждении их светом разных длин волн. Поскольку испускание квантов люминесценции всегда происходит с низшего электронно-возбужденного уровня молекулы, спектр люминесценции будет всегда одним и тем же независимо от того, на какой энергетический уровень попал электрон в результате поглощения фотона. Это означает, что спектр люминесценции не зависит от длины волны возбуждающего света.

Закон Стокса—Ломмеля обуславливает взаимное расположение спектров люминесценции и поглощения и формулируется следующим образом: спектр люминесценции в целом и его максимум сдвинут по сравнению со спектром поглощения и его максимумом в длинноволновую область. это означает, что средняя энергия квантов люминесценции меньше средней энергии поглощенных квантов. Причина этого явления заключается в превращении части энергии поглощенных квантов в тепловую энергию:

hna = hnе + DQ, (14.4.86)

где hna — энергия поглощенного фотона возбуждающего света; hn е — энергия фотона люминесценции; DQ — энергия теплового движения молекулы.

Правило Левшина, называемое также правилом зеркальной симметрии, утверждает, что нормированные спектры поглощения и флуоресценции, представленные в виде графиков e = f(n) и , зеркально симметричны относительно прямой, перпендикулярной оси частот и проходящей через точку пересечения спектров n0, причем для n0 можно записать:

n а +n f = 2n 0 , (14.4.87), где nа и nf — симметричные частоты поглощения и флуоресценции. Частота n0 в выражении (14.4.87) может быть интерпретирована как частота чисто электронного перехода, т. е. перехода между нулевыми колебательными уровнями состояний S0 и S1.

01

Зеркальная симметрия спектров поглощения и флуоресценции характерна для сложных молекул и не наблюдается в случае простых молекул. Ее можно объяснить тем, что геометрия молекул мало меняется при электронном возбуждении, а расстояния между колебательными уровнями и вероятности переходов на них у молекул в основном и электронно-возбужденном состояниях близки.

Более строгое квантово-механическое обоснование правила Левшина дал Блохинцев. Он показал, что спектры поглощения и флуоресценции необходимо нормировать и строить в координатах от n и от n соответственно.

Закон Вавилова устанавливает зависимость квантового выхода люминесценции от длины волны возбуждающего света. Согласно этому закону, фотолюминесценция может сохранять постоянный квантовый выход, если возбуждающая волна преобразуется, в среднем, в более длинную, чем она сама. Напротив, выход фото-люминесценции резко уменьшается при обратном пре-вращении длинных волн в короткие.

Закон Вавилова уточняет закон Стокса—Ломмеля и предусматривает возможность возникновения люминесценции при возбуждении ее светом с большей длиной волны, чем свет люминесценции (антистоксовая область возбуждения). Данная возможность реализуется вследствие того, что молекулы до поглощения квантов света могут обладать значительным запасом колебательной энергии, которая, суммируясь с энергией поглощенных квантов, может приводить к излучению фотонов с большей энергией:

hn е = hn а + Ev , (14.4.88)

где hnе — энергия фотона люминесценции; hna — энергия поглощенного фотона; Ev — колебательная энергия молекулы.

Фотодинамическое действие.

Любой фоторегуляторный процесс включает несколько последовательных стадий:

1)поглощение кванта света и образование возбуждённого состояния фоторецептора

2)фотофизическая реализация энергии возбуждения

3)Сенсибилизация фотохимической реакции

4)образование промежуточных продуктов

5)конечное проявление фотобиологических эффектов

Фотосенсибилизаторами называются вещества, выступающие в качестве первичных фоторецепторов в фотобиохимических реакциях.

Пигменты-сенсибилизаторы большинства фотобиологических процессов до сих пор неидентифицированы (о их природе можно судить только по спектрам действия фотобиологических эффектов). Исключением является пигмент фитохром. Это димер, каждый мономер которого содержит хромофор (фитохромобилин), присоединённый к апобелку тиоэфирной связью. Фитохром обладает фотоконверсией – под действием красного и дальнего красного света он способен менять свою конформацию с изменением максимума поглощения при 660нм (К) и 730 нм (ДК). Дальнекрасная форма фитохрома (Ф730) характеризуется наличием гидрофобной зоны, что позволяет фитохрому взаимодействовать с регуляторными и сигнальными молекулами.

Принцип действия фотосенсибилизаторов основан на эффективном измнении активности ферментов а также проницаемости мембран) при поглощении кванта света. Поглощая свет, молекула сенсибилизатора претерпевает фотохимическую реакцию (например, цис-транс изомеризацию), приводящую к изменению пространственной конфигурации фотохрома,что отражается на характере взаимодействия фотохрома с ферментом.