Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 18
Текст из файла (страница 18)
и. от фрагмента 1900 находится следуюший А-сайт, а с другого конца, на расстоянии 600 п.нн — следуюший В-сайт. На основе этих данных мы можем нарисовать карту, указав на ней вертикальными линиями сайты рестрикции ферментами А и В и размеры фрагментов между ними. Следует иметь в виду, что при реконструкции больших фрагментов из маленьких всегда получается хорошее совпадение размеров (в пределах разрешающей способности метода). Характерной чертой рестрикционных карт является их полная аддитиеность ло длиие.
Теперь мы можем продолжить картирование влево и вправо, определив, из каких фрагментов образуются участки 200 п.н. и 600 п.н. с левой и правой сторон. Фрагмент 200 п.н. получается при расщеплении фрагмента В-1200 ресзриктазой А. Отсюда вытекаез, что следуюший В-сайт должен находиться на расстоянии 1000 п.н. влево. Фрагмент 600 п. н. образуется при расщеплении фрагмента А-1400 рестриктазой В. Тогда следующий А- сайт должен находиться через 800 п.н. вправо. Теперь карта будет выглядеть так: А А А 1000 4 200 1900 Р 800 800 Чтобы завершить построение карты, нужно установить происхождение двух концевых фрагментов. Слева фрагмент 1000 и н.
происходит либо из фрагмента В-!200, либо из фрагмента А-1000. Поскольку В-фермент не разрезает фрагмента А-1000, этот фрагмент должен находиться с краю карты. Другими словами, начиная с левого конца первый А-сайт расположен через 1000 п, н., а первый В-сайт — через 1200 и.н. По этой причине на карте, построенной нами ранее, мы не обозначили В-сайт слева от фрагмента А-1000 (хотя ранее мы формально рассматривали этот конец как В-сайт).
На правом конце карты фрагмент в 800 п.н. получен после обработки фрагмента В-1300 рестриктазой А. Следовательно, правее его располагается фрагмент в 5000 и. н. Поскольку рестрик газа В не расщепляет фрагмента А-500, он служит правым концом и завершает построение карты. Все данные, полученные при сравнении специфического действия рестрнктаз А и В, сведены в рестрикционную карту на рис.
3.3. Таким образом, молекула ДНК размером в 5000 п. н. поделена на серии участков определенной длины, расположенные между участками, специфически узнаваемыми двумя рестриктируюшими ферментами. Некоторые тонкости рестрикционного картирования При построении рестрикционных карт обычно используют несколько рестриктаз, поэтому приходится анализировать сложные соотношения между фрагментами, полученными под действием различных ферментов.
Процедуру картирования можно значительно упростить с помошью специальных приемов. 1200 2500 1300 Риа. 13 Рестрикционная карта ДНК представляет собой линейную последовательность сайтав расщепления, иахаляшихая иа определенном расстоянии друг ог друга. Не карте аакезена расположение сейчае ресшсцесннн фсрмснззмн А н В, которые бычн аарецелсны е резухьтете анализа 46 Часть 1.
Природа генетической информации Один из таких приемов заключается в неполном расщеплении. В определенных условиях эксперимента рестрикгаза узнает и расщепляет не все свои мишени в каждой молекуле ДНК. Например )рис. 3.3), при частичном расщеплении ДНК ферментом А могут образоваться фрагменты 3100 и.
н., 1400 п. н. и 500 п. н. Сопоставив их с тем, что получается после полного расщепления, можно сразу расположить фрагменты 2100 п.н. и 1100 п.н, рядом, как составляющие фрагмента 3100 п.н. Таким путем можно последовательно расположить сайты ресгрикцни одного фермента. При неполной рестрикции можно также получить фрагмент 3500 п.нд тогда можно расположить рядом фрагменты 2100 п.н. и 1400 п.н. Другой удобный прием — это введение концевой метки с помощью радиоактивного фосфора. Так называют ферментативное присоединение радиоактивной метки 1эзР) к 5'- илн 3'-концу молекулы ДНК. В этом случае концевые фрагменты определяются по включенной концевой метки.
Таким образом, фрагменты А-1000 и А-500, а также В-!200 и В-1300 можно сразу расположить по краям карты. Сопоставление фрагментов часто производят с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот. Например, фрагменты А-2100 и В-2500 содержат перекрывающиеся участки ДНК. Следовательно, они будут гибридизоваться друг с дру|ом. Для применения всех этих методов нужно иметь в распоряжении полный набор фрагментов, из которых должна быть построена карта. Однако иногда это условие невозможно выполнить. Если несколько специфических сайтов одного фермента находятся слишком близко друг к другу (например, на расстоянии 50 и.
н.), образуются мелкие фрагменты, которые нельзя обнаружить при элекэ.рофорезе в агарозном геле. Это, конечно, приведет к расхождению при суммировании полученных значений молекулярных масс всех фрагментов. Однако расхождение в молекулярных массах само по себе не обязательно должно настораживать, так как всегда существует некоторое расхождение при сравнении размеров фрагментов.
Комбинируя методы концевой метки и неполного расщепления, можно определить расположение всех фрагментов, полученных под действием одной рестриктазы. Сочетая этот метод с методом перекрывающихся фрагментов, а также используя несколько рестриктаз, можно быть уверенным, что построенная рестрикционная карта включает всю ДНК и ни один из мелких фрагментов не потерян. Дополнительные трудности возникают из-за того, что не все индивидуальные фрагменты можно увидеть в геле в виде отдельной полосы. Так, иногда образуются фрагменты с одинаковой молекулярной массой )или гораздо чаше с настолько близкими размерами, что при электрофорезе они не разделяются).
Для того чтобы убедиться в уникальности каждой полосы, следует обратить внимание иа интенсивность ее окраски. Полоски, состоящие из нескольких фрагментов, должны быть более интенсивно окрашены. Фрагменты с одинаковой молекулярной массой можно различить, используя дополнительные рестриктазы. Подробную рестрикционную карту можно связать с генетической картой. Крупные генетические изменения, т акие, как делеции или вставки, люжно обнаружить методом рестрикционного картирования.
Они приведут к уменьшению или увеличению соответствующих рестрикционных фрагментов. Кроме того, иногда в разультате генетиче- ских перестроек исчезают некоторые сайты рестрикции или же возникают новые. В заключение следуе~ сказать о номенклатуре рестриктирующих ферментов. Рестриктазы обозначают сокращениями из трех, а иногда из четырех букв, соответствующих их происхождению. К сокращению добавляют римские цифры, чтобы различить ферменть~ одинакового происхождения. Например, Нра1 — рестриктаза из Наетар)й!ив рата)п))иепгае, а Есой! — фермент из Е. саа Сайты рестрикции можно использовать в качестве генетических маркеров Генетическая и рестрикционная карты характеризуют один и тот же материал с разных точек зрения.
Однако, сопоставив карты обоих типов, можно установить физическую основу генетической карты. Кроме того, результаты рестрикционного расщепления можно объединить с генетической картой. Рестрикционная карта представляет собой серию сайтов линейно расположенных в ДНК, расстояние между которыми соответствует реальному расстоянию вдоль нуклеиновой кислоты. Рестрикциангоча карту можно получит~ для любви последовательности ДНК, независимо от того, идентифицированы ли на нвй мутации и известна ли чта-нибудь о ев функции. Генетическая карта представляет собой серию сайтов, в которых встречаются мутации.
Выявление этих сайтав основана на том, чта изменение в последовательности оснований вызывает соответствуьэьцее из.иьнвние в фенотипв. Расстояние между этими сайтами определяется по частоте рекомбинации, которая зависит от ряда параметров в каждом конкретном участке. Чтобы сопоставить рестрикциоиную н генетическую карты, нужно сравнить рестрикционные карты ДНК дикого типа и соответствующих мутантов. Связь между генетической и физической картами можно установить па основе одного рестрикционного картироваиия, если имеются мутанты, сильно изменяющие генетическую карту. Например, маленькая делеция или вставка, нарушающая генетическую карту, вызовет соответственно уменьшение или увеличение размера то| о рестрикционного фрагмента, в котором она находится.
Более протяженная делеция гили вставка) может удалять гила вводить) серии рестрикционных сайтов. Такой пример разобран на рис. 3.4. Точковые мутации труднее локализовать на рестрикционной карте. Иногда они могут изменить сайты-мишени для ресэриктирующего фермента. В противном же случае их не удастся определить, так как размеры рестрикционных фрагментов ДНК дикого типа и мутаьпов оказываются одинаковыми.
Поэтому для локализации таких замен оснований часто необходимо определить последовательность оснований в ДНК. Построение генетической карты основано на генетической неоднородности популяции. Сосуществование более. чем одного варианта называют генетическим полиморфизмом. Любой сайт, в котором существуют множественные аллели в качестве стабильных компонентов популяции, считается полиморфным, Например, плодовая мушка )У. те)апоаавгвг полиморфна по серии аллелей покуса иййв, жь,нг, ььь и т.и. Полиморфизм на уровне фенотипа объясняется одновременным существованием в одной популяции мух алле- 3.
Что такое ген? Молекулярная структура С йчм, с зз узшцз ц рззурм ч дзлечич Дц й иа / / / / / / / / Делец з Гзл -злзкчрафарзз р х — ив с — Д вЂ” ~ ! ° $. Р— ц— Š— К— — в —— з в дик в дик ЧдбвдвьчЖЖдьтрдуххрцоб нз адцчз„ чар дадцз сзй з. С мишени Рзещзлле цз Рзачри чируюцчц фзрмзцчам ц злзкчрафарез С МЗ;'Р Рззмзр фРагмента С рзцеч сумме фрзгмечюц А В Д 4 в ля дикочо типа и серии мутантпых аллелей.
Рассмотрим основу такого полиморфизма среди мутанчиых аллелей. Эти мутации изменяют продукт гена таким образом, что функция данного белка оказывается неполноценной, что приводит к изменению фенотипа. Если мы сравним рестрикционные карты или последовательности ДНК соответствующих аллелей, то они гоже окажутся полиморфными в том смысле, что каждая карта или последовательность будет отличаться от другой. Хотя это никак не проявляется в фенотипе, но дикий тип сам по себе может бы гь полиморфиым.
Может иметь место существование измененных вариантов аллеля дикого типа, различающихся по таким изменениям в последовательности ДНК, которые на нарушают функции белка и поэтому не обнаруживаются в виде фенотипических вариантов. С точки зрения генотипа популяция мух может имечь значительный полиморфизм. Может сушествовать много вариантов с различной последовательностью ДНК в ж-покусе, Некоторые из них заметны, поскольку они приводят к изменению фенотипа; другие скрыты, так как онн не имеют видимого проявления. Существование полиморфизма в геноме можно установить, сравнивая рестрикционные карты разных индивидуумов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
