Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Критерием полиморфизма в этом случае служит изменение в характере расположения фрагментов, образованных в результате расщепления рестриктируюШим ферментом. На рис. 3.5 показано, что если в геноме одного индивидуума имеезся сайч-мишень для рестриктирующего фермента, отсутствующий у другого, то в результате дополнительного расщепления в первом геноме образуется два фрагмента, соответствующих в совокупности одному целому фрагменту во втором геноме. Поскольку рестрикционная карта не зависит от функции гена, полиморфизм на этом уровне можно обнаружить пезовигцмо опч того, приводит лц изменение пуклвопчидпой последовагпельности к изменению феччотипа или цепь В действительности только незначительная часть случаев рестрикционного полиморфизма в геноме, по-видимому, проявляется в виде фенотипических изменений. Возможно, что в большинстве случаев имеет место такое изменение последовательности нуклеотидов, которое не ри азйчз.
А в Рцс З б Изменевцд в ДИК, нарушаюшие сайты рестрикции, определяют по образованию других фрагментов рестрикции. А В С ' Ь. Е Р О Н К ряс Зй В результате лелеции исчезает серия рестрикционных сдйтов, а рестрикциоицые фрагменты, расположенные по ее концам, сближаются. Делецид целцком уддллеч фрцгмеюы О л Ь, «очорые лмею уел среди ресгрлкцлоллых фрцгмедюр дикого типа, ло ле у мучзкчд, дерущего делецлю. фрагментов ь л Г дккачо типа также цег у мугцлчд ° делецией. Одччцко вместо цлх у мучцлгц речь новый фрдч мелу Х, котоРый содержлч чдачь последовательности эчцх Лрух фрагментов Фрагменты, рзеоолажецлые ло обоим коццзм лелеццл, Л л В слева к О, Н ц К еччрццк одинаково лредсчделелы кзк е Лехом чзк л е мучдлчцом реочрлкцколцых цереецрцх В случае вставки эффект будеч прямо орочцеололожлым: у мухлюй булуч орлеууачеоецчь дополнительные фрцгмелчы, которых цеч у дикого чипа влияег на образование белков (например.
из-за того, что такие сайты расположены между генами). Различие в рестрикционных картах двух инливидуумов можно использовать в качестве генетических маркеров точно так же, как и любые другие маркеры. Единственное отличие состоит в том, что вместо того, чтобы изучать некий фснотипическнй признак, исследуюч непо- Часть Е Природа генетической информации 48 Радлзелв 1 Маркер 1 Разделение фрагмензов ДН К в зле Пзмрорме Раднза в 2 Мар ер 1 Рвзделима фрасменмв дНК е зпекзрафор за Маркер 2 Цвет глаз Мар ер2 Цвет глаз Анализ о омсзва Род нивские типы 1,'"Уз; Рекамеинанзы 15% Рес рикционнма мар ер распада ен на рассзоинни 15 ед.
каРты аз маркера о репки глаз Рис. 3.6. Рестрикционный полиморфизм можно использовать в качестве генетического маркера лля измерения рекомбина- средственно генотип по его рестрикционной карте. На рис. З.б показано измерение частоты рекомбинации между рестрикционным и фенотипическим маркерами. Тот факт, что рестрикционные маркеры сохраняются при изменениях генома, затрагивающих фенотип, лежит в основе чрезвычайно эффективного метода идентификации генетических покусов на молекулярном уровне.
Типичным примером могут служить мутации с известным фенотипнческим эффектом, которые локализованы на генетической карте, хотя функция соответствующего гена или белка не известна. К этой категории относятся некоторые тяжелые заболевания человека. Это, например, кистозный фиброз, хорея Гентингтона и многие другие серьезные и даже смертельные болезни, которые наследуются по законам Менделя. Во всех этих случаях молекулярная природа мутантной функции неизвестна и, вероятно, она сможет быть выяснена только после того, ционного расстояния по отношению к маркеру, выражающему- ся в феногипе (такому квк окраска глаз). как удастся установить и охарактеризовать соответствующие гены. Если рестрикционные полиморфные сайты распределены в геноме случайно, некоторые из них окажутся около интересующего нас гена-мишени.
Такие рестрикционные маркеры можно идентифицировать по их тесному сцеплению с мутантным фенотипом. Если мы сравним рестрикционные карты ДНК у больных и здоровых людей, то может оказаться, что у больных определенный рестрикционный сайт всегда присутствует (или всегда отсутствует). Гипотетический пример изображен на рис. 3.7. В этом случае сцепление рестрикционного маркера с фенотипом составляет !00%. Это означает, что рестрикпионный маркер находится так близко от мутаптного гена, что никогда не отделяется от него при рекомбинации. Идентификация такого маркера может иметь два важных последствия. Это может привести к выделению 3.
Что такое ген? Молекулярная структура А ализДНКзд роа ллюдеа ~ио зрол ) А а адНКяола ж гена. И это может привести к разработке диагностического метода определения данной болезни. В том случае, если два локуса рекомбинируют редко или не рекомбинируют совсем, рестрикционный маркер должен находиться на генетической карте вблизи от данного генома. Хотя понятие пвблизию в генетическом смысле может оказаться достаточно большим расстоянием в парах нуклеотидов ДНК (табл. 3.1), тем не менее это может служить отправной точкой, от которой можно проследить последовательность ДНК до самого гена (гл. 17). Некоторые болезни человека, которые хорошо изучены генетически, но слабо охарактеризованы с молекулярной точки зрения, трудно поддаются диагнозу. Если же рестрикцнонный маркер тесно сцеплен с фенотипом, то его наличие можно использовать для диагностики болезни в пренатальной стадии или позднее.
Естественно, что большой размер генома человека значительно осложняет определение индивидуального полиморфизма. На практике оказывается даже трудно установить. какую часть генома следует изучать. Однако методы манипуляции с ДНК получили такое мощное развитие (гл. 17), что удалось достичь значительного прогресса в идентификации генов для нескольких болезней чело века. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Мы уже говорили о том, что благодаря специфичности спаривания оснований (С--С и А Т) двойная спираль ДНК сохраняет постоянную структуру независимо от последовательности нуклеотидных пар.
Это означает, что индивидуальные молекулы ДНК различаются последоватечьностью нуклеотидов, а не значитедьными изменениями в структуре. (В противоположность белкам. у которых общая структура белка зависит от послеловагельности аминокислот, но именно эта общая структура в целом определяет биологическую функцию.) Совсем неболыние различия в нуклеотидной последовательносги ДНК могут иметь очень важное значение, поскольку замена одной пары оснований вызывает мутацию. Рис. 3.7. Если рсстрикциппный маркер всегда (или обычно) связан с фепотипическим признаком, зо этот сайт рестрикпии дол- Можно ли точно узнать нуклеотидную последовательность ДНК? Первые попытки определения нуклеотидной последовательности были повторением метода определения аминокислотной последовательности белков: расщепление молекулы на мелкие фрагменты, выяснение нуклеотидного состава во фрагментах и (на основе данных о перекрываюгцихся фрагментах) восстановление полной последовательности.
Однако в случае белков дело обстояло значительно проще. Наличие в белковой молекуле 20 аминокислот обусловливает большое разнообразие фрагментов, тогда как в состав молекулы ДНК входит всего четыре основания. Поэтому описанный метод можно было использовать только для очень коротких фрагментов нуклеиновых кислот. Однако сейчас стало возможным прямо определять последовательность ДНК. Более того, эта процедура проще, чем определение белковой последовательности. Все используемые методы определения нуклеотидной последовательности сводятся к тому, чтобы получить серию одноцепочечных молекул ДНК, различающихся по размеру на одно основание. Такие молекулы можно разделить с помощью электрофореза в акриламидном геле.
Полосы, соответствующие молекулам различной длины, образуют «лестницу» длиной до 300 нуклеотидов. Для получения таких наборов различающихся фрагментов используют в основном два подхода. В одном случае ДНК химически расщепляют по одному основанию. Другой подход заключается в том, чтобы синтезировать нужную последовательность ДНК ш т11го, специфически останавливая синтез на заданном основании. Для определения нуклеотидной последовательности молекулы ДНК ее обрабатывают четырьмя разными способамн, каждый из которых специфически действует только на один тип оснований. Продукты расщепления подвергают электрофорезу, помещая их на четыре соседние дорожки одного геля. Полоски, соответствующие молекулам определенного размера.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
