Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 20
Текст из файла (страница 20)
появляюзся только на одной из четырех дорожек. Это позволяет определить нуклеотид, находящийся в данном положении на ДНК. Переходя от одной полоски к полоске болыпего размера, можно ппрочитатьр всю последовательность нуклеотидов. При использовании химической обработки ДНК сна- жеи находиться рядом с геном, отвечающим за данный феио- тип. Часть 1. Природа генетической информации ттадсасстдадттастмат гсаттдсдсСпецизлыгаа обработке дая разрыва цели па остаткам б тт дсассълдттасмдаттсаттдсдс * ттадс сстдадттастддаттсаттдсдс .
ттаясасстд дттастддаттсаттдсдс-* ттадсасстматт стддагтсаттдсдс. ттадс сстдадттастм ттсаттдсдс.. тгадсасстд дтшстматтс ттдсдс-" ЗЗЕКГМЦ)ЮРЕЗ ДЕИГИфикзци» мегеиы фрзгмеигое „г'гт 24 ; 19 ;- и дениз ааааа Дик,меченная еод огакоица Рззаывы ца С Разрывы яо(Сзт) (гидразина еолз) ( идразии) Разрывы ло С Рюрмез аа Д (дМС з иагрееаиие) (АМС з кисло з) рис. 3й Положение отдельного основания в одноцепочечяых фрагментах ДНК можно определить с помощью злектрафореза, наметив канвы фрагментов радиоактивной меткой и обработав ДНК соответствующим реагентом. В качестве примера показан опыт, где полинуклеотид был разорван по остаткам О.
Некоторые молекулы имели только один разрыв, другие— несколько. Однако н каждом случае один конец анализируемых молекуя был помечен (показано звездочкой). Набор ме геных фрагментов в условны этого опыта еоегояя иэ молекул, размер которых соответствовал расстоянию от оплота конца до каждого положени» О в исходной ДНК При разделении в электрофорезе фрагменты разнон длины образуют полосы, положение которых в геле зависит ог их длины. чала исследуемый фрагмент метят с одного конца радиоактивным фосфором и затем специфически расщепляют полинуклеотид по одному из четырех оснований.
Суть этого метода заключается в том, чтобы расщепление происходило случайно в каждом одном из чувствительных положений с вероятностью примерно 1-2;:,. Таким образом, сначала препарат ДНК содержит большое число идентичных молекул, меченных с одного конца. После химической обработки каждая молокула будет разрезана только в небольшом числе участков, содержащих данное основание. Но весь препарат в целом будет состоять из набора молекул, у которых разрыв случайно произошел практически в каждом положении данного основания )рис.
3.8). Полученные молекулы подвергают электрофорезу и радиоактивно меченные фрагменты идентифицируют радиоавтографически. Каждый фрагмент образует полоску, размер которой зависит от расстояния места разрыва до меченого конца. В результате каждого типа химической обработки образуется пелая серия полосок, указывающих на положение всех соответствующих оснований по отношению к меченому концу молекулы. В исходном методе специфическое расщепление по пуринам производили, используя диметилсульфат. Это соединение метилирует Х7-положение гуанина примерно в 5 раз эффективнее, чем )ч(3-положение аденина. При нагревании метилированное основание удаляется из ДНК, образуя разрыв в полинуклеотидной цепи.
Поскольку реакция происходит более эффективно с гуанином, остатки Сх образуют темные полоски, тогда как остатки А— светлые полоски )что соответствует более редкому рас- щеплению). Противоположная картина будет наблюдаться в том случае, если для удаления метилированных оснований вместо нагревания использовать обработку кислотой.
Это дает возможность определить местоположение А и О по отдельности. Для анализа пиримидинов используют гидразин, который эффективно реагирует с цитозином и тимином. Однако при высокой концентрации соли реакция идет только с цитознном. В итоге можно получить две серии полос, одна из которых будет соответствовать только С, а другая-С + Т.
Как показано на рис. 3.9, четыре реакционные смеси подвергают дальнейшему анализу. Сначала проводят электрофорез на параллельных дорожках. На каждой иэ четырех дорожек образуются полоски, соответствующие молекулам, специфически разорванным в местах расположения однгтго из четырех оснований.
Пгуследовательность ДНК читают от полоски к полоске по мере увеличения размера на одно основание. Поскольку внизу геля находятся самые короткие фрагменты, последовательность читают снизу вверх. Насколько точно можно таким способом определить последовательность ДНК? Как мы уже говорили, ряд химических реакций позволяет определить последователь- Зцеигаофорзз и идентификация фрегиеигае е ко ценой мегкои 6 — — — '.+ С хам .~.даг С:;,' д ;,ча т "° 6 6 рис. э.й Используя набор реакций, специфичных )щя каждо)а отдельного основания, можно определить последовательность ДНК.
Одну и ту же ДНК использовали в четырех независимых реакциях и затем реакционную смесь разлепили в электрофорезе. Поеледователанаегь читают сразу по всем четырем дорожкам геля, переход» снизу вверх оз паласы к полосе, как показано зигзагом Положение О, А и С опрелеляют по трем левым дорожкам На правой порожке нахолитея сумма С н Т, поэтому разница третьей (С) и четвертой (С + Т) дорожек позволнег определите положение Т.
Таким образом, погяедовательность ДНК, изображенную на рисунке, можно прочитать: конец Н, — ОАОСАТСАСООТАОСТАОАОТА.. В самой нижней части тел» обычна находятся фрагменты размером около 20 п.н., поэтому чтение последовательности начинаегея е этого раосгояния ог меченого «анна фрагмента. Ближе к верхней части геля полосы раепаяагаютея теснее, и поелепователвнооть уже нельзя прочитать. 3. Что такое ген? Молекулярная структура 5! Пге тчг-1 ~- тм ар щч пгч~.вег 0,7 2,3 0,7 0,4 47 2 . . Г 1О 5 , ( ! 7,0 )! 12,4 / / ! 1 ! ъ ! // ! )! ! рд Аминокислот г Ч дикого типа 15,0 П) ! В) 1 5 Рекомбиирч оииаи карга г а 12,7 7,7 0.02 0,5 щ„.,! ~,м 7,7 10,2 е пе Аге-~ 40,5 гла чи дмниоиис огы ч мч еитв пь Ага чтг Рнс З !О Рскомбинапнанная карта гена триптафан-сиитнзы соответствует аминакислатнай последовательности этого белка.
Вертикальными черточками показаны мутациониые сайты, определенные по аминокислотиым заменам в белке и по картированию мутаций в гене. Расстолние между черточками указывает на расстояние между мутациями на карте (выраженное в процентах рекомбинации) Общий размер гена составллст ЗД ед. карты, что соответствует 268 аминокислотам данного белка.
Следовательно, одна аминокислота в срсд- ность одной цепи ДНК. Конечно, всегда существует вероятность ошибки. Однако для повышения точности анализа можно независимо проанализировать обе цепи. Выявляют все участки, в которых не наблюдается комплементации н в которы, следовательно, возможны ошибки, и их уточняют. При таком методе определения ошибки очень редки, До сих пор мы рассматривали определение последовательностей в случае определенных, но коротких фрагментов ДНК. А как перейти к определению нуклеотидной последовательности длинных молекул? Так же как и при рестрикционном картировании, метод состоит в использовании перекрывающихся фрагментов.
Предположим, что у нас есть серия последовательных фрагментов, расположенных следующим образом: Мы можем прямо определить последовательность каждого нз этих фрагментов, но, для того чтобы быть уверенным, что мы не потеряли мелких фрагментов, образованных в результате расщепления ферментом двух близко расположенных участков (проблема, обсуждавшаяся в предыдущем разделе), важно продолжить определение последовательности через места соединения фрагментои. Для этого нужен еше один набор фрагментов, в котором оставались бы интактными места соединения А — В. И так же, как можно построить рестрикционвую карту перекрывающихся фрагментов, можно построить и общую последовательность ДНК, анализируя перекрывание отдельных последовательностей ДНК.
Колинеарны ли гены и белки? Представление о том, чхо каждая цепь ДНК служит матрицей при синтезе комплементарной цепи (при репликации), существенно и для определения прнролы гена, и для установления его связи с процессом белкового синтеза. Каждый ген экспрессируется путем образования А В д В Д В ~ 200 ~ 200 ~ 150 ~ 200 ~ 150 ~ нем соответствует 0,015 ед. карты. (При анализе индивидуальных пар мутаций наблюдаются отклонения от этой величины) На нижней схеме можно видеть, что в двух случаях получены мутации, раз,гелаемые при рекомбинации, которые вызывают замену одной и тай же аминокислоты на верхней схеме )показано расходлщимис» пунктирными линиями) В одном случае тюлин заменен на аргиннн или валин, в другом-на цнстеин и аспарагиновую кислоту. Формально зто указывает на га, что единица рекомбинации !одна пара оснований) меньще единицы. кодирующей данную аминокислоту (три пары оснований).
РНК-посредника, которая служит матрицей при синтезе белка (см. гл. 5). Здесь важно запомнить, что последовательность нуклеотидов в матричной РНК точно соответствует последовательности аминокислот в белке. У бактерий последовательность нуклеотидов в матричной РНК (мРНК) точно соответствует последовательности одной из цепей ДНК и комплементарна другой цепи -той, которая направляет ее синтез с помощью того же механизма, который используется при репликации,— комплементарного спаривания оснований. В двух экспериментах, выполненных на бактериях, было формально показано, что ген и его продукт колииеарны; иными словами, последовательность нуклеотидов в гене точно соответствует последовательности аминокислот в белке.
Такой ход мысли аналогичен хому, что на основании однотипности частот рекомбинации внутри одного гена и между генами делается вывод о том, что структура хромосомы в генах и межгенных промежутках однотипна. Все это дает основание рассматривать бактериальный геном как длинную молекулу ДНК, последовательные участки которой дегерминируют различные белки. В первом эксперименте сравнивали расстояние между мутационными сайтами с расстоянием между амивокислогными заменами в белке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
