Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Но если сконструировать тройных мутантов, то комбинации типа ( + + + ) и ( — — — ) будут иметь дикий фенотип, другие же комбинации останутся мутантными. Из этого следует, что код считывается триплетами, так как тройные вставки и тройные делеции добавляют или удаляют только по одной аминокислоте. Измененная часть белка ограничена при этом участком между первым и третьим мутационными сайтами (рис. 4.3).
Предсказание о том, что у двойных и тройных мутантов измененная часть белка ограничивается областью между мутировавшнми участками, не удалось проверить на гП-системе, К сожалению, тогда этот белок был недоступен. Однако это предсказание было подтверждено на другой системе при анализе анало!.ичного типа. 4. Расшифровка генетического кода Аппарат для последовательного белкового синтеза М 59 Если генетический код читается как серия триплетов, белок синтезируется последовательно с одного конца до другого.
Впервые это продемонстрировал Динцис (йЗзпийб), исследуя белок эритроцитов — гемоглобин. К клеткам, синтезирующим гемоглобин, добавляли радиоактивно меченную аминокислоту. Затем выделяли целый белок, расшепляли его трипсином и исследовали содержание метки в пептидах из разных участков молекулы. На рис. 4.4 показано, что радиоактивная метка может включаться во все возможные участки белка, в зависимости от той точки, в которой находился синтез данной молекулы в момент добавления метки.
Но в целых, завершенных молекулах радиоактивность содержится только в том конце, который синтезируется последним. Если увеличить время мечения, то метку можно обнаружить и в начале молекулы. Из этого следует, что радиоактивность включается в обратном порядке — от конца к началу. Согласно этим данным, белок синтезируезся в направлении от Х-конца к С-концу.
Как мы уже говорили в гл. 3, первая ступень экспрессии гена состоит в образовании мРНК, копирующей одну цепь ДНК. Это совпадает с представлением о том, что любой из двух комплементарных цепей двойной спирали достаточно для кодирования. Цепь, имеющая пзу же последовательность, что и мРНК (с той лишь разницей, что в ней содержится Т вместо (1 в РНК), иногда называют кодируюшей цепью. Другая цепь, которая обеспечивает синтез мРНК путем комплементарного спаривания оснований, оказывается антикодируюшей цепью. Поскольку генетический код считывается с мРНК, его обычно записывают, используя четыре основания, присутствующие вРНК: ь),С,А,О.
Синтез одноцепочечной мРНК на ДНК называют транскрипцией. мРНК служит матрицей, по которой аминокислоты собираются в полипепэидную цепь. Этот процесс получил название нэрансляция», поскольку именно на этой стадии нуклеотидные триплеты дешифруются как определенные аминокислоты. Трансляция выполняется специальными клеточными органеллами — рибосомами. Рибосомы — это частицы, состояшие из РНК и белка слегка сплющенной сферической формы. Как мы увидим в следующей главе, они Прикрепляются к мРНК на 5'-конце и передвигаются вдоль полииуклеотидной цепи по направлению к 3'-концу, попутно транслируя каждый гриплет в аминокислоту. Из-за различия структур нуклеотида и аминокислоты сразу возникает вопрос: как каждый кодон подбирает свою определенную аминокислоту? Еше до того, как код был расшифрован, Крик предположил, что посредником в зрансляции может служить особая молекула †надаптор».
Ею оказалась транспортная РНК, сокрашешьо тРНК, состоящая из 75-85 нуклеотидов и являющаяся самой маленькой РНК в клетке. Каждая тРНК обладает двумя необходимыми свойствами адаптора. Она способна узнавать только одну аминокислоту, с которой она коваленпию связывается, и превращается в амииоацил-тРНК. Аминоацил-тРНК в свою очередь способна связываться с рибосомой, выполняя вторую важную функцию тРНК.
Каждая тРНК имеет тринуклеотидную последовательность — антикодон, который комплементарен кодону, соответсгвуюшему данной аминокислоте. Поэтому тРНК узнает кодаи путем Белноеые целя на раз ых езаднях еннтеза Рзацйбнунензя метка 'д' '"' аабаелена махорочное время и с ййййййййййййййййййзпизпжйеййййййййл лйййейййезыйцийейййаййциелциййй выделены полные лалнлыпнднь е молекулы. У неназарых нз н * помечен С-нонец, назарый шзнюзнруезш лоеледннм Прн увели еннн лер ода ммення балы ее чнало лз ул аназ езе е аннзезнроеаннмм лалнаауью, лозуаму ла бюахцнн целых маленул мзюно наблюдаз еред ензенлючен а ма нн, ноуарнй уменьшается оз С.на «е н й.нонну Рнс.
4 4 Белки синтезируются в направлении от И-конца к С-концу. Радноахтнанад метка ахпючаезся ао пае раогупхззе у застал полнпептндной цепи олнохременно. После аыделеннл полных белковых молехул метну можно обнаружить а тех участкам молехуя, которые былн еннуезнроеаны последними. Гралнену метки от С-ханца х Врхонду показыааеу, чуо синтез происходит н противополОжном направлении комплементарного спаривания оснований. В рибосоме одновременно находятся два вида тРНК для двух последовауельно расположенных кодонов.
Таким образом, между двумя находящимися в рибосоме аминокислотами образуется пептидная связь. Кодоны, соответствующие аминокислотам Когда была установлена триплетная природа зенетического кода, казалась, что нелегко будет найти подход, позволяющий расшифровать кодоны для всех аминокислот. Но очень скоро было разработано два метода, с помощью которых расшифровали большинство кодонов, Систему для белкового синтеза можно получить в виде бесклеточного экстракта (см. гл.
6). Исходная процедура состояла в следующем: клетки бактерии Е. сой разрушали, нз полученного экстракта методом центрифугирования удаляли фрагменты оболочек и мембран. ДНК разрушали добавлением ДНКазы (а бакгериальная мРНК слишком нестабильна и не могла служить эндогенной матрицей). Полученная в результате надосадочная фракция активно транслирует любую добавленную мРНК, поскольку в этой фракции содержатся необходимые предшественники и источник энергии. Позднее были разработаны другие системы, содержашие более чистые компоненты. Такие системы были созданы из многих типов как прокариотических, так и эукариотических клеток. Синтетические полннуклеотиды стали применять для синтеза белка после того, как в 1961 г.
Ниренберз и Мат- 60 Часть 1. Природа генетической информации теи (Ь)(гепЬегя, МаггЬае!) сообщили, что ро1у(1)) — полиуридиловая кислота- может служить матрицей, как и мРНК. При этом !и И!го из фенилаланнна синтезируется полифенилаланин. Из этого следовало, что триплет (ЛЛ) должен быль кодоном для фенилаланина. Аналогично этому гомополимеры ро!у(С) и ро!у(А) стимулировали синтез полипролина и полилнзина. Следующей ступенью в этих исследованиях стало использование г«теролояимсров, содержавших более одного основания и способных направлять включение в белок нескольких аминокислот. Такие гетерополимеры можно приготовить, используя фермент полинуклеотид-фосфорилазу (обычный фермент меваболизжа нуклеиновых кислот), которая сшивает вместе нуклеозиддифосфаты.
(Эта искусственная ситуация является единственным исключением из правила, согласно которому предшественниками для синтеза нуклеиновой кислоты служат трифосфаты.) Если отдельные нуклеотиды включаются в полинуклеотид случайно, тогда частота образования случайных триплетных комбинаций должна совпадать с относительным количеством каждой аминокислоты в белке. Более точный метод разработал Корана (КЬогапа), который синтезировал полинуклеотиды известной последовательности.
Это дало возможность установить точную корреляцию между кодонами и аминокислотами в полипептиде. С помощью этого метода была расшифрована примерно половина всех кодонов. Ниренберг и Ледер (Ь)!гепЬегя, Бег)сг) в !964 г. разработали другой метод расшифровки кодонов. Тринуклеотиды известной последовательности стимулируют связывание специфических молекул аминоацил-тРНК с рибосомами. Это имитирует процесс взаимодействия кодона с антикодоном, происходящий на рибосомах между тРНК и мРНК. Связывая рибосомы на нитроцеллюлозных фильтрах, можно выделить тройные комплексы: тринуклеотид аминоацил-тРНК.
рибосома. Сама аминоацил-тРНК не связывается с нитроцеллюлозными фильтрами, но ее можно выделить в составе комплекса: эффективность специфического связывания измеряют по радиоактивной метке, используя меченую аминокислоту. Определив, какая из 20 меченых аминоацил-тРНК задерживается на фильтре, с помощью этого метода (получившего название метод связывания рибосом) установили специфическое значение всех тринуклеотидов.
Два описанных выше метода позволили определить значение 6! из 64 кодонов. Однако в экспериментах обоих типов реакции проводили ш ч!!го, поэтому следовало подтвердить, что полученные данные справедливы н ш чпш Первая серия доказательств того, что кодоны имеют такое же значение в живых клетках. была получена прн анализе мутаций. Мутации, инлуцнрованные заменами оснований, коррелировали с амннокислотными заменами в белке. Сопоставление белка дикого типа и участка белка между двумя мутациями типа «сдвиг рамки» также выявило четкую корреляцию между измененным смыслом кодонов и последовательностью аминокислот в испорченном участке белка, Эксперименты такого рода подтверждали, что смысл колонов был определен правильно, но они отнюдь не доказывали, что ш х)чо и ш и!!го кодоны считываются одинаково. Однако позднее благодаря развитию методов определения нуклеотидной последовательности ДНК гюявилась возможность прямо определять кодоны, Мы уже говорили о том, что теперь можно быстрее узнать последовательность самого гена, чем его продукта.
Гены с из- ПРИРОДа СИГНаЛОВ ТЕРМИНаПИИ Только 6! из 64 триплетов используется для обозначения аминокислот. Какова же функция оставшихся трех кодонов? Триплеты Т)АО, (ЗАА н 1)ОА являются кодонамитерминаторами, на которых синтез белка останавлнваеэ- ") ва 3 -Х" «А6 ! ТЕРМ вас г Оба Фен ОСА ТЕРМ вав гр в«в ха„ вес! ввф !) Й) гас Т «« сх» $ ж„ с»а у Ач 3 Яю х»с М ввак аае «« аея а«а Аи а«с Аь вх» зь аяа Рлс. 4.5. Все триилетные колоны осмысленны.
Ш«стьаес»~ оЛин ыо«ов ««ответствует амин«кис»атал~, » все амико««ь лоты, за исключением шип~оф«иа «мы»они««, «саируютс«н«с«алък«- ии колонами. Колоны-синонимы обычно образуют группы, в к«вары« два первых основании в ко»он«я»а«юте» общими, а третье- варьирует. три «алая«вызывают т«рминацию (тввм), повяло«ее««ванин в кодо. н« записан, «а« обычна, в направлении от К-ко«аа к Зс«о«ау. вестпыми белковыми продуктами можно прямо читать триплетами, сопоставляя тексты ДНК и белка. Последовательность кодирующей цепи ДНК, прочитанная в направлении 5' — 3', состоит из триплетов, соответствующих аминокислотам в направлении от Ь)-конца белка к С-концу. Таким методом была получена полная характеристика генетического кода, которая целиком и во всех деталях подтвердила прежние результаты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
