Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Каким образом можно установить молекулярную структуру гена и соотнести ее со структурой белкового продукта? Насколько далеко друг от друга расположены соседние гены? И как мы можем выявить участки, расположенные между ними? Генетическое картирование ставит своей конечной целью определение нуклеотидной последовательности гена и прилегающих к нему участков впло~ь до соседних генов. Для этого нужно прежде всего выделить ДНК, соответствующую данному гену. Сначала это сделали на вирусах, у которых легко выделить всю геномную ДНК.
С тех пор, однако, выделение любого типа клеточной ДНК стало почти общедоступной процедурой в том случае, если есть соответствующий белковый продукт (хотя при малом количестве белка выделение специфической ДНК может занять довольно мно!о времени). Затем следует построить карту ДНК. Для этого ДНК разрывают в определенных точках, расстояние между которыми можно точно измерить. Такие точные разрывы возможны благодаря рестриктврующим ферментам (ферменты рестрикции, рестриктазы), мишенью которых служат короткие специфические последовательности ДНК.
Карта ДНК, гюлученная в результате локализации точек разрыва, называется рестрикционной картой. Она представляет собой линейную последовательность сайгон, в которых определенные рестриктируюшие ферменты специфически узнают свои мишени. Расстояние между сайтами рестрикции измеряют прямо в нуклеозидных парах ДНК (сокращенно и. н. для коротких отрезков и т. (п.) н.— тысяча (пар) нуклеотидов для длинных отрезков). После построения физической карты можно перейти к определению последовательности ДНК между близко расположенными точками (обычно около 300 и.н.). Выбирая подходящие точки, отдельные расшифрованные последовательности можно соединить в последовательность целого гена.
Затем установленную последовательносэь ДНК сравнивают с последовательностью соответствующего белка. Это позволяет выявить участки ДНК, отвечающие за структуру белка. Продолжив определение последовательности в одном из направлений. определяют расстояние до следующего гена. Сравнивая между собой последовательность ДНК дикого типа и его мутантного агшеля, можно точно локализовать мутационный сайт и установить природу мутации. Таким методом определяе!ся соответствие между генетической картой (целнком основанной на мутационных сайтах) и физической картой (составленной па основе нуклеотидной последовательности ДНК).
В конечном итоге карту како!о-либо участка генома можно выразить в нуклеотидах ДНК, а не в относительных единицах карты, принятых в формальной генетике. Действительно, теперь можно идентифицировать !ены по их белковому продукэу и даже ино!да только по нуклеотидной последовательности. Таким образом, при построении карты генома мы 44 Часть Е Природа генетической информации днк амдеппют ДНК н пааледуют м етода злектрафорезз Ныделпют ДНК н наследуют ее ме одам злектрафарезе 2000 — — — 2000- — —— — — — — -21 00- — — — " ; 2000 Рзежеп.
ле е азате тззан 8 больше не зависим целиком от мутаций как от необходимого сырья. Однако мутации по-прежнему играют важную роль при идентификации функций генных продуктов. Рестриктирующие ферменты расщепляют ДНК на специфические фрагменты Ключом к рестрикпионному картированию служат свойства одного класса ферментов, обнаруженных у бактерий (более детально эти ферменты рассматриваются в гл. 34 в связи с их естественным распространением).
Мы уже говорили, что рестрнктирующие ферменты режут двухцепочечную ДНК в специфических участках. Каждый рестриктирующий фермент имеет свою особую мишень. Обычно это специфическая последовательност.ь нуклеотидов длиной от 4 до 6 пар оснований. Фермент режет ДНК в кажлой точкез тле встречается такая последовательность. Разные рестриктирующие ферменты имеют различные последовательности-мишени. Сейчас в распоряжении исследователей находится большой набор рестриктаз.
(Их применение детально описано в гл. 19.) Если взять определенную молекулу ДНК и обработать ее подходящим рестрнкт'ирующим ферментом, то в строго определенных местах произойдут разрывы, которые разделят ДНК на ряд отдельных фрагментов. Эти фрагменты можно фракционировать по размеру методом гель-электрофореза. Для этого препарат разрезанной ДНК наносят сверху на агарозный гель. Прн наложении электрического поля фрагменты начнут перемещаться вниз по гелю со скоростью. зависящей от их длины.
Чем короче фрагмент. тем быстрее он движется. (Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму длины фрагмента.) В результате злектрофореза в геле образуется ряд полос. Те полосы, которые располагаются сверху геля, соответствуют большим фрагментам, а те, которые снизу— маленьким. Если гель прокалибровать, то можно определить длину любого индивидуального фрагмента ДНК. Для этого на одну из дорожек геля наносят контрольную пробу.
Контрольная проба солержнт смесь стандартных фрагментов известного размера (нх часто называют маркерами). Соо гношение между размером исследуемого фрагмента и пройденным им расстоянием устанавливают по скорости миграции маркеров. Пример использования этого метода показан на рис. Зси Индивидуальную молекулу ДН К длиной 5000 п. и. обрабатывают отдельно двумя реет риктазами — А и В. Разрезанные фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза. Можно видеть, что фермент А разрезал ДНК-субстрат на четыре фрагмента размером 2100, ! 400, 1000 и 500 и.
н., тогда как фермент В образовал три фрагмента размером 2500, 1300 и 1200 п.н. Можно ли на основании этих данных расположить сайты рестрикции в определенном порядке и построить рестрикционпую карту? Существует несколько методов сравнения фратментов, полученных при расщеплении двумя различными рестриктазами. Общая схема одного метода, использующего процедуру двойного расщепления, показана па рис. 3.2. Суть этого метода заключается в гом, что исследуемая ДНК обрабатывается не одной, а двумя реет.риктазами.
Наиболес полный вариант такой процедуры со- ', Е 1000 -.;; — — -тдоо — — — —:. таво — — 1 200 — —— 'зу — — — — — 10)0 — — — — —.. 1000 -+ — — — 000-- — — 000 ревмеппзнне Ка троп реатрнк. (етзндзртныз тезок д фрзтма ты нзвеетнато рззмерз) Рнс. 3.(. Рестрнктируюшне ферменты расщепляют ДНК на отдельные фрагменты, которые можно разделить методом здектрофороза н агарозиом геле. Размер ннднвндулльных фрагментов, обрпзовпнных ферментолт А (спевл) нпн ферментом В (апрпвп), определпют орпвненнем с положением фрлтментов нзпестното размера, покпзвнных нв контрольной дорожке зпектрофорезд (в нентре).
стоит в том, чтобы экстрагировать каждый фрагмент, образующийся в результате расщепления одним ферментом (А или В), а затем обработать его вторым ферментом. Смесь фрагментов, полученную после расщепления, анализируют с помощью электрофореза, Каждый тель на рнс. 3.2 обозначен в соответствии с использованным ферментом и размером фрагментов, которые были экстрагированы из гелей, изображенных на рис. 3.!. Так, «А-2!00» означает фрагмент в 2100 п. нп полученнь)й в результате обработки исходной молекулы ДНК ферментом А.
После того как этот фрагмент извлекли из геля и обработали рестриктазой В, образовались два фрагмента размером 1900 п. н. и 200 п. н. Другими словами, разрез, сделанный ферментом В, находится на расстоянии 200 п.н. от ближайшего разреза ферментом А с одной стороны и на расстоянии 1900 п.н.— от ближайшего разреза ферментом А с другой. Относительное положение разрезов видно при анализе чувствительности фрагмента В-2500 к ферменту А. Фрагмент В-2500 разрезается на два фрагмента размером 1900 п.н. и 600 и. н, Таким образом, фрагмент 1900 п.н. образуется в результате двух разрезов — в А-сайте с одного конца и В-сайте с другого. Поскольку этот фрагмент образуется в результате расщепления двух разных фрагментов (А-2100 и В-2500)з можно думать, что эпт фраз менты перекрываются и область размером 1900 п.н.
является для аих общей. 3. Что такое ген? Молекулярная структура 45 Ача Расщепление фермен ам А Ресщеппение ферменчам В в в в 2500 1300 1200 А А А А 2100 1400 1000 500 з за а зааа юа еаа еаа ~~ часа еса юоо 14ОО 500 210О А В Кире . 1000 200 А В А 1:' ' 1 .'1 1000 600 500 500 ' Риа. 3.2. Сравнение результатов обработки ДНК двумя рсстриктазами дает возможность определить положение сайтов расшеплевив алии и ферментом по отношению к сайтам расщепления другим ферментом. Четыре фрзеыентз, полученные е результате действия рсстрнхтезы А (сы рнс. 3.1), ззюнраепхн нз геле н абребатепн рестрнетезай В (четыре гец» слепа).
Тех:ее зрн полоски, рану ~снныс цасле абребатен рестрнхчазай В, выделили н абребателн рестрнктазай А (трн геля е центре). В «ан гральнай арабе ннтехтную ДНК абребазыеезн двумя рестрнхтеземн ацнаерсменна (гель сцреее). После того как проведен подобный анализ всех фрагментов, становится ясно, что каждый фрагмент, полученный из исходных А-фрагментов под действием фермента В, можно также обнаружить в образцах, содержаших фрагменты, полученные в результате расШепления исходных В-фрагментов ферменюм А.
В геле, содержашем все продукты двойного расщепления (правый гель на рис. 3.2), каждый фрагмент встречается один раз. Эти данные позволяют однозначно расположить на карте сайты рестрикции. Построение рестрикционной карты Использование перекрывающихся фрагментов — это ключ к рестрикционному картированию. Рассмотрим лля примера уже известный нам фрагмент в !900 п.н. Он образуется либо в результате обработки фрагмента А-2100 ферментом В, либо после обработки фрагмента В-2500 ферментом А. Из данных о расщеплении фрагментов А-2100 и В-2500 мы знаем, что с одной стороны на расстоянии 200 п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
