Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Неспаренный участок образует петлю шпильки, если он расположен между соседними комплементарными последовательностями, находящимися в противоположных направлениях. Внутренние петли образуются, если в потенциально комплементарных последовательностях встречаются некомплементирующие вставки. Даже одно лишнее неподходящее основание в потенциально комплементарных цепях вызывает дефект в двойной спирали, Поскольку неспаренные области мешают образованию двойной спирали, все такие помехи учитывают при подсчете и включают в общую сумму, 2. Что такое геи? Биохимическая точка зрения — — — — — — -1,5 — — — — — — т,г — — — — — -г.г — — — — — -4,8 — — — — — — -2,2 — — — — — — -1,2 С ртктуре ео елерен ммн ое швенкям» вЂ” — — — — — -1,6 — — — — — — -1.2 — — — — — — -1,2 +2 — — — -2,2 ----- — — 1,5 — -2,2 — — — — — — -з,о — — — — — -2,2 — — — — — --т,г — — — — — — -г,г — — — — — — -4,5 Летпя лоееь й ры шпняькн Левый край етебл» шлнл «к Ойноеепочечнен структуре 5 О 6 6 С 6 О О С 6 О А С О О А А А О А О 6 6 А А О Рис.
2.13. Свободную энергию потенциально двуспирлльиого участка высчитывают как сумму значений дб. Эти знвчени» могут бьиь отрнпвтельиыми (энертия высвобождения в ре- причем каждому типу помех в отдельности придается кологюигиельиое значение свободной энергии. Иными словами, требуется дополнительная уашраитп энергии, чтобы удержать эти участки в пределах данной структуры. Эта энергия-обратного знака по сравненииз со свободной энергией спаривания оснований и стэкинг-взаимодействий.
Все конкретныс величины приведены на рисунке. Общая сумма свободной энергии должна обязательно быть отрицательной величиной, иначе вторичная структура не сможет образоваться. ДНК можно денатурировать и ренатурнровать Структуру двойной спирали ДНК (или РНК), скрепленную водородными связями, можно разрушить нагреванием. Поскодьку спаренные цепи не связаны между собой ковалентно, после разрыва всех водородных связей две полинуклеотидиые цепи ДНК полностью разделяются. Процесс разделения цепей называют деиатурацией или плавлением.
Денатурация происходит в узком интервале температур и отражается в кардинадьном изменении многих физических свойств ДНК.Особенно полезным оказалось изменение оптической плотности. Гетероциклические коль- ласи а О О с с а А О О О О с 6 с О а с 6 а а с О с с 6 з' зультвте спвриввння оснований) иян положительными (нужнв дополни- тельнвя энертня, длн того чтобы удержать неоперенные учвстян в пре- делах соответствуюглей двуспнрельной конформялнл). ца нуклеотидов поглощают свет в ультрафиолетовой области (с максимумом, близким к 2бО мкм, характерным для каждого основания). Но поглощение, характерное для самой ДНК, почти на 40"„меньше, чем поглощение смеси свободных нуклеотидов того же состава.
Это явление, называемое гипохромиым эффектом, обусловлено взаимодействием электронных систем оснований в результате их стэкинг-взаимодействий при параллельном расположении в двойной спирали. Любое отклонение от двуспирального состоиния немедленно сказывается в изменении величины этого эффекта. Иными словами, происходит сдви~ оптической плотности в сторону значения, характерного для свободных оснований. Таким образом, за денатурацией ДНК можно наблюдать, исследуя ее гиперхромность.
Срелнюю точку температурного диапазона. при которой происходит разделение цепей ДНК, называют точкой плавления и обозначают тп . Пример кривой плавления, полученной по измерению оптического поглощения, показан на рис. 2.14. Кривая всегда имеет одну и ту же форму, но ее положение на температурной шкале зависит от состава оснований ДНК и условий, использованных для денатурации. Когда ДНК находится в растворе примерно в физиологических условиях, тттл лежит в диапазоне 55-95 С. Точ- Часть 1.
Природа генетической информации Зб вить двойную спираль. Это явление называют ренатурацией (рис. 2.15). Ренатурация зависит от специфичности спаривания оснований между комплементарными цепями. Реакция происходит в две стадии. Сначала короткие комплементарные последовательности двух цепей случайно соединяются друг с другом и образуют двуспиральный участок. Затем область спаривания, подобно застежке- молнии, распространяется вдоль молекулы и образуется длинная двухцепочечная структура. Реконструкция двойной спирали завершается восстановлением первоначальных свойств, утраченных при денатурации ДНК.
1,4 й 1,З о й з,г О 1,1 х,о Нуклеиновые кислоты гибридизуются путем спаривания оснований уо с ео с Рис. 2.!4, Денатурация ДНК характеризуется значением Т„,. Экспсримснтазхьно за лснатурацисй ДНК можно сводить по изменению сс оптической плотности. Оптичссхос погзхопхснис -в условных винницах. я няо сохрхвяннх основания Оаноцчяочхчяхя д Рчнхтурхровхянх» дии двухвхо чхчнхя дНК Рис. 2.15. Отдельные цепи денатурированной дНК могут рена- 4-цвуцспочсчная ДНк, Б-дснатурапня, В-начахо спаривания основатуриронать с образованием двуспирадьной молекулы.
пнй, à — рснатурированная ДНК. нос значение зависит от состава оснований. Пары Π— С, связанные тремя водородными связями и имеющие ббльшую свободную энергию образования, оказываются более тугоплавкими, чем пары А — Т, связанные двумя водородными связями. Зависимость Тп, от состава оснований лннейна. При каждом увеличении содержания О С- пар значение Т„увеличивается на 0,4'С. Так, ДНК, на 40; состоящая из Π— С !что типично, например, для генома млекопитающих), будет денатурировать при Тп„ около 87'С в обычных условиях, тогда как ДНК, содержащая 60% Π— С, прн тех же условиях будет иметь Тп около 95'С. Решающее влияние на Т оказывает ионная сила раствора.
Т„л возрастает на !б,б'С при каждом десятикратном увеличении концентрации моновалентных катионов. Чаще всего реакцию проводят в 0,12 М фосфатном буфере, что обеспечивает концентрацию моновалентных ионов )ч)а", равную 0,18 М. Значение Тп„сильно меняется прн добавлении в реакционную смесь таких веществ, как формамид, которые дестабилизируют водородные связи. Их присутствие позволяет снизить 7„'л до 40*С и тем самым избежать дополнительных повреждений ДНК (таких, как разрыв цепей), вызываемых повышением температуры. Чрезвычайно полезное свойство денатурации ДНК— это обратимость процесса.
При определенных условиях две разделенные комплементарные цепи могут восстано- В ренатурацин участвуют две комплементарные последовательности, которые были разделены при денатурации. Олнако метод ренатурации можно использовать применительно к любым комплементарным последовательностям, способным образовать двухцепочечную структуру при совместном отжиге. Если исследуемые кислоты взяты из различных источников, это явление обычно называют гибридизацией — например, в том случае, когда подвергают отжигу ДНК и РНК.
В основе гибридизации лежит тот же принцип спаривания комплементарных оснований, который обеспечивает реплнкацию ДНК или ренатурацню молекул. Действитедьно, способность к гибридизации двух препаратов нуклеиновых кислот служит строгим тестом на комплементарность их последовательностей. В общих чертах метод гибридизации заключается в совместной инкубации двух одноцепочечных препаратов нуклеиновых кислот и последующем измерении количества образованных дуплексов. Существуют лва основных способа провеления этой реакции: гибридизация в растворе и гибридизации на фильтре. Метод гибридизации в растворе ясен из названия: препараты одноцепочечных молекул смешивают в растворе. При большом количестве материала за реакцией можно следить по изменению оптической плотности.
Если в реакции участвует небольшое количество материала, олин из компонентов метят радиоактивным изотопом и по количеству метки в лвухцепочечной ДНК судят об эффективности гибридизации. Для такого измерения 2. Что такое ген? Биохимическая точка зрения 37 Денатурацил дик Денетурацил лик в раатВОти ддоордцнн рамелен. ныл цепей на фильтре удаление фильтаи нз раотвора и определен е нопитеатее овазанной ДНК Рис. 2.16. С помощью гибридизации на фильтре можно опреде- лить, содержит лн данный препарат ДНК (или РНК) последова- тельности, комплементарные нукхеиновой кислоте, иммобяли- зованной нд фильтре. оставшиеся одноцепочечные молекулы подвергают специфической деградации или разделяют одно- и двухцепочечные молекулы методом хроматографии. Определенные затруднения в использовании этого метода возникают в том случае, когда один или оба исследуемых препарата содержат двухцепочечную ДНК.
Например, если две двухцепочечные ДНК денатурировать и затем смешать вместе, то могут одновременно происходить реакции двух типов. Единичные цепи могут ренатурнровать с образованием исходных молекул, но, кроме того, каждая цепь может гибридизоваться с комплементарной последовательностью другой ДНК. Поскольку обе реакции конкурируют между собой, трудно оценить степень гибридизации.
Это затруднение можно преодолеть, если иммобилизовать один из препаратов ДНК таким образом, чтобы он не мог ренатурировать. Для этой цели используют нитроцеллюлозные фильтры, которые адсорбируют одноцепочечную ДНК и це адсорбируют РНК. Фильтры с адсорбированной одноцепочечной ДНК обрабатывают специальным образом, для того чтобы предотвратить дальнейшую адсорбцию одноцепочечных молекул. На рис. 2яб показана схема эксперимента, в котором препарат ДНК денатурировали, полученные олноцепочечные молекулы адсорбировали на фильтре и затем добавляли второй препарат денатурированной ДНК (или препарат РНК). Связывание второй нуклеиновой кислоты происхо- дит только в том случае, если она может комплементарно спариваться с ДНК, первоначально адсорбированной на фильтре.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
