Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 52
Текст из файла (страница 52)
(Единственное исключение — зто ДНК )угаеар61)а и некоторых других насекомых, которые практически не содержат ш~С.) Почти всегда т'С встречается в составе динуклеотида СрО; частота метилирования С в паре СрО для различных организмов и типов тканей варьирует в пределах 20 — 80",~,' (см. Донолненне 16.2). Этот динуклеотид представляет собой «минипалиндром», в связи с этим метилнрованне в одной цепи всегда сопровождается метилированием соответствующего остатка С в комплементарной цепи. 227 Дополнение 16.2. Анализ метилирования ДНК Мзтг ! нр и Еса К! Ф Ею К! -1 о ь! ьг тл.н Есо К! Есо К! -ь Мтр ! Есош+Нр И Пееень Сперма Кяетоеная Мозг нонна Люба» т ань Любая ткань о т.п н 16.
Регуляция экспрессии генов у эукариот В изучении состояния метилирования эукариотических ДНК важную роль сыграло обнаружение двух рестриктаз Нрав и Мзр1, узнающих одну и ту же тетрануклеотидную последовательность ССОО, однако по-разному реагирующих на состояние метилирования внутреннего остатка С. Метилирование этого остатка за- А Рис. 16.14. Обнаружение метилированных по- слеловательностей ССОО в (3-глобиновом гене кролика. При расщеплении Его й! обра- зуется протяженный фрагмент, содержащий большую часть ()-глобинового гена, включая оба интроиа (показаны белым) и 5'-фланки- рующую последовательность.
Этот фрагмент после электрофореза и переноса по Саузериу регистрируется по птбридизации с ратшоак- тивным зондом (слена). Расщепление этого фрагмента рестриктазой Мяр1 происходит независимо от степени метилирования содер- жащихся в нем последовательностей ССОО (середина). Характер расщепления этого же фрагмента рестриктазой НраП позволяет выявить уровень тквнеспепифичиого метили- щищает последовательность от расщепления НраП, но не Мзр1, благодаря чему удается легко тестировать метилирование определенной части динуклеотидных сайтов Сроь входящих в сос~ав узнаваемых этими рестриктазами четверок — ССОО. Так, абсолютно неметилированная ДНК характеризуется одним и тем же ровапия ССОО-послеловательностей (справа). Данный фрагмен! в составе ДНК спермы полностью метилирован, о чем говорит его абсолютная нечувствительность к действию НраП.
В то же время этот фрагмент, содер- жащийся в ДНК, полученной из культуры кроличьих клеток, неметилирован и в одина- ковой степени подвержен расшеплеиию Мяр! и Нрап, При изучении ДНК из клеток моз- га и печени обнаруживается профиль расщепления, представляющий собой смесь тех, что изображены на рисунке слева и в середине, Таким образом в этих клетках имеет место неполное метилироваиие со- ответствующих последовательностей.
(По Нагш Ан Идйл А.Н., 1980. Бстепсе, 210, 604.) 228 Определенные сайты метилирования в ДНК соматических клеток оказываются метилированными также и в ДНК дочерних клеток. При полуконуервативной репликации последовательности СшвССтО, в которой метилированы обе цепи, дочерние ДНК первоначально получают только по одной метилированной цепи. В эукариотических клетках присутствует так называемая поддерживающая метилаза, которая вскоре узнает возникшие при репликации «полуметилированные» сайты и метилирует остаток С в соответствующем сайте новосинтезированной пепи ДНК (рис.
16.15). В то же время уровень метилирования ДНК и клетках данного типа подвержен изменениям. Изменения в уровне экспрессии генов данной клетки часто сопровождаются процессами метилировання и деметилирования (рис, 16.15) определенных сайтов, расположенных в области ло- Поллсрвнвающее метнпирование Метилированнс Пе пото Е СН3 — со— — сс— сн 1 — сов — ос— 1 — — — — + Лсмстнлнраввние 3 Па насте мстипирав ними сант — со— — сс— Реплнкаюы днк Репликаан» Неметнлираваиный сант Полу метилнЗюваниый сант профилем электрофоретического разделения фрагментов рестрикции как НраП, так и Мзр!.
В то же время в случае метилирования одной или более последовательностей ССОО обнаруживаются различия в наборах рестрикционных фрагментов, полученных при обработке ДНК этими рестрнктазами (рис. 16.14). Более того, если метилирование некоторого сайта в ДНК не является полным (то есть часть молекул ДНК в популяции метилирована, а часть — неметнлирована по данному сайту), то электрофоретический анализ препарата, полученного при обработк ДНК рестриктазой НраП, выявляет картину, которая представляет собой сочетание электрофоретических профилей, показанных на рис.
16.4. Таким образом, при сравнении результатов электрофореза препаратов, полученных при расщеплении ДНК рестриктазами НриП и Мзр1, можно Рнс. 16.15. Три возможных состояния мети- лирования СО-сайтов в двухспиральной ДИК. Полуконсерватнвная реплнкация пол- ностью метилнрованного сайта привалит к образованию полуметнлнроййнного сайта, т.е. метипнрованного только по остатку С родительской цепи. Подцержнвающая ме- тнлаза узнает такой сайт н метнлнрует со- Экспрессия генетического материала выявить степень метилнрования сайгон ССОО в данном препарате ДНК. Распределение сайгон метилирования в определенных генах можно изучить с помощью переноса и гибридизации по Саузерну электрофоретически разделенных фрагментов рестрикции с использованием в качестве радиоактивных зондов искомых клонированных генов (рис.
16.14). Метилнрование тех или иных остатков может быть также выявлено при анализе нуклеотидной последовательности по методу Максама-Гилберта. Метильная группа в пз'С блокирует специфическое расщепление по этому остатку, поэтому отсутствие соответствующего фрагмента в наборе, образующемся при статистическом расщеплении по С, указывает точную локализацию модифицированного основания. ответствующий остаток новообразованной цепи, наследственно зикрепляй таким образом полностью метнлнроианное состояние данного сайта. Поскольку этот фермент узнает только полуметнянрованные сайты, положение неметилнрованных пайтон также закрепляется наследственно.
1б. Регуляция экспрессии генов у эукариот 229 кализации генов, для которых наблюдается изменение уровня экспрессии. Появление в области генов, расположенных в районах изменения структуры хроматина, новых участков, чувствительных к расщеплению ДНКазой 1, как правило, сопровождается по крайней мере частичным деметилированием сайтов СшвСОО, находящихся вблизи или внутри соответствующих генов. Известна также корреляция между протеканием вирусной инфекции и процессами метилирования ДНК. Линия клеток, трансформированных вирусом герпеса Саймири, но не продуцирующих в заметных количествах вирусного потомства, характеризуется высоким внутриклеточным содержанием эписомных копий высокометилироваиной вирусной ДНК.
В то же время клеточные линии, отличающиеся активной продукцией вируса, содержат практически неметилированную вирусную ДНК. Аденовирусная вирионная ДНК также неметилирована. Однако, когда эта ДНК интегрирована в хромосомную ДНК и не транскрибируется, она оказывается метилированной.
Аналогично проретровирусная ДНК в клетках, не отличающихся высокой продукцией ретровируса, мегилирована. Впрочем, следует отметить, что подобные корреляции сами по себе не могут выявить причинно-следственной связи между метилированием — деметилированием и регуляцией экспрессии. Прямые эксперименты показали, что метилирование может быть непосредственной причиной инактивацни генов.
Это можно проиллюстрировать на примере аденовирусной транскрипционной единицы, кодирующей белок, специфически связываюшийся с вирусной ДНК, которая была клонирована в векторе рВК322. После инъецирования клонированной ДНК в ядра ооцитов Хепориз во фракции РНК удается обнаружить транскрипты аденовирусного гена. Однако в случае предварительного метилирования вирусной ДНК 1п уйго с помощью Нра11 транскрипции аденовирусного гена в аналогичных условиях не наблюдается. Характерно, что этот эффект связан с метилированием одной или более специфических ССОО-последовательностей, а не с метилированием как таковым, поскольку обработка ДНК метилазой Ввий1, модифицирующей последовательности ООСС, никак не отражается на транскрипции.
Пока еше неясно, каким образом метилированне оказывает ингибирующее влияние на процесс транскрипции. Связь метилирования с процессами регуляции активности генов представляет особый интерес, поскольку, как было отмечено выше, состояние метилирования тех или иных сайгон может закрепляться в ходе передачи наследственной информации при полуконсервативной репликации. Как будет рассмотрено в гл. !7, выбор путей дифференцированного развития клеток в ходе эмбриогенеза закрепляется на уровне точной передачи наследственной информации при пролиферации того или иного типа дифференцированных клеточных линий.
Поэтому изменения в распределении метилированных сайгон в процессе эмбрионального развития могут быть положены в основу привлекательной, хотя и непроверенной еще гипотезы, объясняющей каким образом может наследственно закрепляться выбранный путь дифференцированного развития различных зародышевых клеток. 230 Экспрессия генетического материала Регуляция гемоглобиновых генов в ходе развития организма Определенный вклад в формирование представлений о связи регуляции экспрессии генов с развитием организма внесли работы по изучению биосинтеза гемоглобина у птиц и млекопитающих. Молекулы гемоглобинов, как отмечалось в гл.
1О, представляют собой тетрамеры, содержащие по две пары глобиновых цепей различного типа. В ходе развития организма наблюдается образование различных вариантов гемоглобина в зависимости от экспрессии различных типов а- и б-глобиновых генов. В табл. 16.4 показан субъединичный состав различных гемоглобинов, образующихся в ходе развития человеческого организма. Экспрессия различных а- н ()-глобиновых генов строго упорядочена, но осуществляется различными типами клеток в различных тканях в зависимости от стадии развития эмбриона (рис.
16.16). С использованием генно-инженерных подходов удалось изучить расположение этих генов в ДНК, а также зарегистрировать изменения структуры хроматина и ДНК, связанные с регуляцией экспрессии этих генов. Как и-, так и б-глобнновые гены образуют кластеры тесно сцепленных генов.
Оба кластера генов были клонированы в виде набора рекомбинантных фаговых векторов, содержащих перекрывающиеся фрагменты глобиновых генов, с использованием методов, описанных в гл. 9. Расположение генов внутри кластеров показано на рис. !6.!7. Интересно отметить, что некоторые глобнновые гены представлены более чем одной копией (ам а„ну, "у), причем на соответствующей стадии развития происходит одновременная экспрессия обеих копий. Удивительной особенностью организации кластеров оказалось то, что гены в них расположены в соответствии ох порядком их экспрессии и все транскрибируются с одной н той же цепи ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
