Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 48
Текст из файла (страница 48)
!бхй Мутантные гены !)с полученные, как показано на рнс. 16.2. Нормальная последова- тельность соответствуюглей области гена Й приведена в верхней строке )показаиа только послеловательность неколируюглей пепи). Встраивание в эту последовательность Вам Н)-лин- кера на различных участках приводит к возникновению нуклеотидных замен, выделенных цветом. Эффективность транскрипции для каидого из мутантных генов указана в табл. 16.2 (По МОКл!д)зт 5.Х., К!лдзЬигу Я0 1982.
Бс!енсе 217, 316.) -)20 — 200 2Ю вЂ” 0 -00 -20 Р 20 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! стлтслтслс лслмссссс ссслса тот тстмпссс сллпссмс лислслта лстссиит. аг ссг кос ли тсслг п ссслтлплл итслсастстсссстссл лслссслссс лссстсслсс Ген дикого типа ссссслксс сслллсссст. ссслситсг тсгслпссс сллпссмс Оса лслтсв лассссссз. Озсасстсгс ли тсслсп ссслтлплл саслссссгстсссстссллслссслислгсстссли. ь -ое-ег Экспрессия генетического материала Тцбляцп 16.2. Эффективность транскрипции мутаитпых генов г/с, показанных на рнс. 16.3, в ооцптах Хепприэ Эффектпппссть экспрессии Эффектпвпссть экспрессии Мутант Мутант Е$-!19/-!09 1$-!15/-!05 1.$-1!1/-101 1.$-!05/-95 1.$-95/-85 1.$ — 84/ — 74 1.$-80/-70 Б$-79/-69 Е$-70/-61 1,20 1,36 0,04 0,03 0,12 0,09 0,87 0,70 0,94 Е$-59/-49 1.$ — 56/ — 46 1.$ — 47/ — 37 Б$ — 42/ — 32 1.$ — 29/- 18 1.$ — 21/-12 Б$ — 16/-6 Б$-7/+3 Е$+ 5/+ 15 0,08 0,1 1 1,27 0,68 0,06* 0,07 0,96 1,04* 1,18» точке, стлпчцсй ст псрмэльпсй точки ппцппеццц !982 Ясппсе, Х!7, 3!6.
» Трцпскрппццп пачпппетсц в трепскрцпцпп, Пс МсКищт К!., Кэпяэьегу К экспресснроваться во многих типах эукариотических клеток, о чем свидетельствует инфекционная активность вируса по отношению к широкому спектру эукарнотических организмов, а также способность воспроизводиться в соматических клетках многих типов тканей. Во всех случаях иа 5'-конце РНК-транскрипта гена !/с обнаруживается одна н та же последовательность, что указывает на способность промотора !/с функционировать идентично в разных типах эукариотических клеток.
Для идентификации в 5'-фланкируюшей последовательности нуклеотидов, вовлеченных в регуляцию транскрипции гена й, можно было бы вводить мутации в каждое положение. Такой подход оказался бы чрезвычайно трудоемким. Более эффективный метод, названный яинкерпым сканированием, был использован в работе Мак-Найта и его коллег.
Этот метод (рис. 16.2) включает создание в клонированном гене г/с двух наборов делеций-с левого и с правого конца клонированной последовательности. Протяженность делеции в каждом делеционном варианте фиксировали с помощью определения нуклеотидной последовательности. Были получены 43 различные делеции с 5'-конца и 42-с Зцконца, вошедшие в состав мутагенизироваиных таким образом генов !)с(рис. 162). С использованием подходящих делеционных мутантов нз каждого набора можно было сконструировать гены, содержашие мутации замещения и отличающиеся от нормальной последовательности !/с в десяти илн менее положениях нуклеотидных пар. Некоторые нз этих мутантных последовательностей показаны на рис.
16.3. В каждом случае влияние замещения определенных участков последовательности на эффективность транскрипции определяли, инъецируя очередную конструкцию, состояшую из клонируюшего вектора рВК322 со встроенным мутантным геном !)с, в ядра ооцитов Хепориа После 24 часов ннкубации из ооцитов экстрагировали суммарную РНК и определяли в ней содержание и структуру транскрипта гена гц. Результаты, представленные в табл. 16.2, позволяют выявить три участка в 5цфланкирующей последовательности, необходимые для эффективной транскрипции гена !/с (отмечены на рис.
16.4). Более того, оказалось, что участок, расположенный ближе других к точке инициации и содержащий 16. Регуляция экспрессии генов у эукариот 2!3 Первая днетальная Прокенмальная последовательность последовательность -61 42 52 (ТАТА) 16 Вторая днетальная последовательность Сайт капнровання †!65 -80 1 — с ссасссяосотсттотсдтто с ТАТА-последовательность, необходим для точного выбора начальной точки транскрипции. Изменения в этом участке приводят к тому, что транскрипция инициируется на других нуклеотидах и с гораздо более низкой частотой.
Рассмотренные эксперименты убедительно свидетельствуют о том„ что район, содержащий ТАТА-последовательность, образует функционально важные контакты с РНК-полимеразой 11, необходимые для ориентации фермента в положении, позволяющем ему начать транскрипцию с правильной точки. Точное функциональное значение более отдаленных участков, отмеченных на рис. !6.4, представляется не столь очевидным. Соблюдение фиксированного расстояния между дистальными участками и ТАТА-последовательностью не является необходимым условием эффективной транскрипции (вспомним, что расстояние между участками — 10 и — 35 в прокариотических промоторах, напротив, является критическим).
Об этом свидетельствуют результаты экспериментов, отраженные на рис. 16.5. Траискрипционная активность некоторых мутантов указывает на то, что РНК-полимераза 11 не образует контактов с дистальными последовательностями и ТАТА-последовательностью одновременно и что другие компоненты, влияющие на транскрипцию, не имеют специфического сродства к дистальным участкам, а вступают во взаимодействие с РНК-полимеразой, зафиксированной в области ТАТА-последовательности. Если бы такие контакты были необходимы, то изменение расстояния между соответствующими участками (см.
рис. 16.5) оказывало бы существенное влияние на эффективность транскрипции. Возможное функциональное значение дистальных последовательностей будет обсуждаться в дальнейшем. Терминация транскрипции считываемых РНК-полимеразой 11 транскрипционных единиц происходит по-разному в зависимости от организма и от конкретной последовательности. Так, в дрожжах механизм терминации заметно отличается от соответствующего механизма у высших эукариот. За исключением гистоновых мРНК, все молекулы мРНК модифицированы с 3'-конца добавлением ро!уА-хвоста. Сравнение 3'-концевых участков ряда мРНК позволило выявить наличие универсальной последовательности АА(3ААА или очень близкой к ней на расстоянии около !5 нуклеотидов от точки полиаденилирования (рис.
16.6). Эта последовательность отсутствует не только в гистоновых мРНК высших эукариот, но и во всех дрожжевых мРНК. С помощью мутагенеза 1п И!го было показано, что эта последовательность выступает в роли сигнала полиаденилирования новообразованных РНК-транскриптов. Делеция этой последовательности приводит к образованию аномально ы мунк Рис, !6.4. Нуклеотндные последовательности, существенные для транскрипции гена тй Идентификация этих последовательностей основана на данных по транскрипции клониронанных мутантиых генов, показанных на рис.
16.3, н ооннтах Хенорщ. (По Кл!рбт 5. 1., !982. Се(1, 31, 355.) Экспрессия генетического материала Кэп- сэтп пп-2 Ген дикого гппэ Пп-1 — — -+9 — е— — - — — +10 — — .е-.—.. э — — — +22 - —— — 430 — — +42 — — -- — - — -+50 —. — —. - +25 — +! ОΠ— +140 — -- . — — — — -- — — +190 — — - — — — — — - — --э в ооцнтах Хепорпэ по сравнению с эффек- тивностью для гена йс дикого хипа: ( + + ) †означа уровень транскрипции, сопо- ставимый с нормальным; (+ — ) — 10 — 2(Гу от нормального уровня транскрипции;(— — )-менее 197, от нормального;(ч- + + )-транскрнлцнонная активность в пять раз выше нормальной.
дп-днстальная после- довательность, пп-прокснмальная последова- тельность (По МсКп(ООГ 5.2., 1982. Сей„31, 355.) длинного транскрипта, полнаденнлирование которого происходит после следующего аналогичного си~нала, входящего в состав следующего считываемого сегмента ДНК. Сигнал ААААА может находиться на значительном расстоянии от истинной точки терминации транскрипции. В случае )3-глобинового гена млекопитающих сигнал полиаденилировання расположен на расстоянии 1400 нуклеотидов от 3'-конца транскрипта, а истинная природа собственно термннаторного сигнала неизвестна.
Очевидно, что расщепление первичного транскрипта РНКазамн до сайта полнаденилировання является частью созревания мРНК. С другой стороны, в клетках дрожжей процесс полиаденилирования»вляется частью процесса истинной терминации транскрипции на терминаторной последовательности, структура которой еще не установлена. Истинные терминаторные последовательности были идентифицированы в транскрнпционных единицах гистоновых генов.
Сравнение 3'-концов гистоновых мРНК ряда высших эукариот позволило выявить весьма характерную последовательность. содержазцую инвертиро- Кэп. Пп -2 Пп-1 и стяг Б Ген дикого типа -!о + +9 — - -Ф +10 — - — - .. '+ — — — - +!б — — — .+ +— — — — -+24- — — — - — — . '+— — эзб — +50 — — - .+80 - --- — — -- э — — — — — -+120 — — — — - —. — +!50 — — — . -- — —. — +180 — +22О— .+280 Рнс.
16.5. Мутантные гены г(г с систематически изменяющимися расстояниями между первой н второй днстальной последовательностями и последовательностью ТАТА, полученные с помощью введения делеций нлн вставок чужеродных фрагментов в ДНК гена дикого типа, Для каждого мутанта указан размер удаленного ( — ) нлн встроенного ( ь ) фрагмента ДНК в нухлеотннных парах. Справа припедены данные по оценке эффективности транскрипции мутантных генов 215 1б. Регуляция экспрессии генов у эукариот !б а.Главни О.6.6.О.С-О.О.О-С-А-А-О-А-А-А-6О-С43-6АС О-6А-С О-С С С Ро1УВО кравика 20 О.С.С С-О-А-А-13-А-А-А-С С А А-А-134)-О А43 "О4343 С"А "О О.66угь(у(А) краника 16 О.66О.С.О-О-О-С-А-А-О-А-А-А-СО.С.О.С А.С (3.С С С С.6 С С-Ро)У(А) еалльнека 20 ОСССОААОААААААСАОО1)АО134313САО436Сра1У(А) В ловли 1В Легквл пень А-А-О-А-О4)-С-А-А-О-А-А.А-6-6.6.А-С-О-С43-О-О-6С-А.С-О-О-6-ро(у(А) лммунаглабулнна мыши 14 С-С-13.О-О-А-А43-С-А-О-А-А-(3-А-А.А"А-А-С-А-О-6434343-А-А'СгС-оо!у(А) овальбу Рис.
16.6. Участки последовательности различных мРНК, предшествующие области посттраискрипциоииого полиаденилироваиия. Выделены сегменты, выступающие в роли сигналов полиаденилирования (По Ргоиг)уоо( Аг.1а Вгошл)ее 6. 6, г'а(пге, 263, 211.) Рис. !6.7. ЗсКоицевые области гистоиовых мРНК содержат показанную иа рисунке характерную последоба.юльность, способную к формированию шпилечиой структуры за счет образования водородных связей между иуклеотидами, помеченными стрелками (По В(гсйпе(ег С, бгомсаей( йе Вппббе! М.1., 1982. СеП, 28, 739.) ААС66С-СТТТТСАй6ССАССА 3' +А тт Т С Т-А С-6 С,Т-А,6 С-6 6-С 6-С ААС АССАои ванные повторы и способную образовывать шпилечную структуру, которая напоминае~ структуру термина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
