Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 43
Текст из файла (страница 43)
В активной форме белок с! представляет собой димер, структура которого поддерживается нековалеитными взаимодействиями между С-концевыми доменами двух субъединиц. Оба Х-концевых домена связываются кооперативно с палиндромными последовательностями каждого из трех участков Ов!, Ов2 и ОкЗ. Прн индукции протеиназа КесА расщепляет полипептидную цепь на участке между доменами. В результате этого нарушается кооперативность связывания, что проявляется в значительном снижении сродства индивидуальных Х-концевых доменов к центрам связывания в операторной области.
Связывание очищенного димера с1 с изолированной ДНК Ок изучали с помощью метода «футпринтинга». Таким образом удалось оценить относительные Ояря г1 ггр Р,О, Рям Ока Окг ггр Ркм гге Ояа Ока гз- 1 ННз МЕТ СЬП СЬН Акц рррл— сттттттстсстсятАссттААятстАтслссссллсолтлАААтАтстллслссцтссотсттслстАттттАсстст6ссссгслтллтссттсслтстАстААоцАссттстлтссАлсллссс СААЛАААСАССАСТАТССААТТТАСЛТЛПТССССТТСССТЛТТТАТАСЛТТСТСССЛСССЛСЛЛСТОЛТААААТССЛСЛСССССЛСТАТТАССАЛССТАСАТСАТТССТССААСАТАССТТСТТССС *Фрррр — — — — — — — Аррр ННз Рис.
15.16. Последовательности ДНК, РНК и белков внутри и вокруг операторной области Оя фага я. Отмечены три участка связывания репрессора. Показаны точки инициации транскрипции генов сю н с1. Звездочками помечены шесть оснований на участке Ояз. которые в структуре транскрипта гена с1, вероятно, используются для прочного связывания с рибосомой. 1По Ргаайае М, ег а1., 1980. Се11.
19, 1.) 191 15. Регуля!(ия экспрессии генов у прокорпев Г Он 2 н( Г он ! концентрация 'в. '.в(я:(кв йк ая «в-!в!уввв репрессора значения концентрации с1, при которых каждый из трех центров связывания белка защищается от действия ДНКазы 1. Как показано на рнс. 15.! 7, при низких концентрациях с1 приблизительно в равной степени защищаются участки Он1 и Он2. Для защиты участка Он3 необходима значительно более высокая концентрация белка с1. В таблице 15.3 приведены относительные значения концентрации с1, прн которых для каждого из участков связывания наблюдается защита половины операторов от действия ДНКазы. Таблвяа 15.2.
Свойства белков, продуктов генов с1 н сто фага !. Белок Величина субъедннпцы Активная форма Относительное сродство к центрам связывания с1 236 аминокислот Днмер Сго 66 аминокислот Дпмер Онз > Оа2 - Он! Оя! Он2 > Онз Кооперативное связывание двм еров Негативная регуляция на; Позитивная регуляция на: Есть Нет Рн и )нм Рнм Рнм Рпс. 15.17. Специфич- ность связывания ре- прессора с1 фага л с последовательностя- ми Он! Он2 и Онз* оцениваемая с по- мощью «футпрннтян- га» (см. Дополнение !4.21 Расщепление ДНКаэой 1 рестрик- ционных фрагментов, содержащих область Он я меченых эгР Расщепление проводи- ли в присутствии воз- растающих концентра- ций репрессора.
Кон- центрация репрессора дана в единицах мо- лярностп (нМ) в расче- те на ! субъеднннцу репрессора. (Соиггезу о1 А. (3, !ойпзоп, В.З. Меуег, М. Ргазйпе, В(о!ой)са! (лбогагог!еа, Нагтап( ()и!«егзйу.] Аналогичные опыты были поставлены с очищенным )«)-концевым доменом с1, полученным с помощью ограниченного протеолнза. Обратите внимание на данные, представленные в таблице 15,3, которые свидетельствуют о том, что для изолированного )«)-концевого домена в отличие от натнвного белка наблюдается сильное сродство к участку Он! и приблизительно одинаковое, более слабое сродство к обоим участкам Он2 и Он3. Наблюдаемые различия в поведении белка по отношению к участку Он2 указывают на возмож- 192 Таблица 15З.
Относительные концентрации белков, необходимые для защиты различных участков области Оя от расщепления ДНКазой 1 оаг Белок о с1 (нвтивный дямер) с1 (Х-концевой домен) Сто 25 82 500 ! 2 82 500 8 ! 3 300 8 По Яоьмол А.В, Меуее В., Реоевее М. (1979) Ргое. Ь1в1. Асад. Бсь !!БА, 76, 5061. Р „, ('*включен" ) ле (" выключен" 1 Ряс. 15.18. Схема, иллюстрирующая связывание двух димеров репрессора фа- га ). с участками Ол ! и Ох 2.
)ч(-концевой домен субъединицы рспрессорв, расположенной с левого края, контактирует с РНК-полимервзой и облегчает ИинцнаЦИЮ тРаНСКРИПЦИИ С Рвм. (СсиПЕВУ О1 1.ЕОПатд Опатов!с, 1ЕВГСУ 8. ХУЕ, Апп НосЬесЫ!д, апд Маг)ч Рьчв)епе, В!осоеш!вггу 1зсраггщев1, Нагчап1 1!п1еегягу) нос участие С-концевых доменов нативного белка с1 в обеспечении кооперативного связывания димеров с Ол! и Ох2.
Такая кооперативность, вероятно, играет важную роль в поддержании репрессии профага. Как известно, связывание белка с1 с оператором О„предотвращает инициацию транскрипции с промотора Рго но не мешает транскрипции с Р„„, благодаря которой поддерживается необходимый уровень синтеза самого белка с1. Моделирование процессов связывания дает основания предполагать, что в результате связывания димеров с1 с участками Ол1 и 0„2 один из )ч)-концевых доменов белка на участке Ок2 может контактировать с РНК-полимеразой, связанной с Рки (рис.
! 5.18). Не исключено, что такой контакт меже~ оказа~ься необходимым для образования открытого комплекса между полимеразой и Р„и, В этом случае белок с1 будет выступать в роли позитивного регулятора транскрипции с Ркм. Обнаружены му~анин, изменяющие отдельные аминокислотные остатки в )ч)-концевом домене белка с1, которые не сказывались на способности белка связываться с ДНК, Экспрессия генетического ееатериала но подавляди его способность к активации транскриппии с Р„„. Структурные исследования белка с! показали, что зти аминокислотные остатки действительно расположены в области возможных контактов с РНК-полимеразой (рис. 15.18). Таким образом, при связывании с 0„! и 0„2 белок с1 стимулирует дальнейшую наработку этого белка.
В то же время при высоких концентрациях с1 он может связываться также и с участком 0„3 (см. табл. 15.3), что приводит к подавлению транскрипции с Р„ы. Следователыю, белок с1, изначально получивший название Х-репрессора, в действительности может играть как позитивную, так и негативную роль в регуляции своего собственного синтеза и в то же время служить негативным регулятором транскрипции с промотора Ря. Эксперименты по защите от расщепления ДНК в присутствии белка Сто показали, что этот димерный белок при низких концентрациях связывается преимущественно с Олу, а при высоких концентрациях может связываться также с Ок2 и 193 15.
Регуляция экспрессии генов у прокариога Ок1, не проявляя кооперативности в связывании димеров с соседними центрами связывания (см. табл. 15.3). Это позволяет считать, что в физиологических условиях ш е(чо белок Сто связывается только с 0„3, блокируя транскрипцию с Р„и, но не препятствуя инициации транскрипции с промотора Р„. Таким образом, альтернативная транскрипция с промоторов Ра или Ряи контролируется относительным содержанием белков Сто и с1 и особенностями их специфического взаимодействия с центрами связывания в области О„. Молекулярные основы узнавания регуляторными белками определенных участков ДНК удалось во многом прояснить благодаря кристаллизации и рентгеноструктурному анализу трех важнейших белков-регуляторов: белка Сто, ДНК- связывающего домена белка с1 и САР- Л ссс Ш а! аг аз Рг рз -Фй(йИе)й — 4вИ-.Фя" Р))~ - -— 1! ы аг аз е ю — — ейй~'э —.
з)й--: пей ь —::еЫ вЂ” эйй6%! Репрессер Л Рнс. 15А9. Регуля- торные белки, связы- вающнеся с ДНК, обладают общими структурными особен- ностями. А. Вторичная структура белка сто н субъединнцы репрес- сора с1 характеризуют- ся наличием пары оди- наково расположенных а-спиральных участков (а2 н аЗ). Ес Ориента- ция пары а-спиралей обеспечивает точное структурное соответ- ствие размерам н фор. ме большой бороздки двойной спирали ДНК, где происходит специ- фическое взаимодей- ствие определенных ос- нований н амннокис- лотных остатков.
Таким образом, дости- гается специфичность связывания белка с определенной после- довательностью ДНК. (По Баиег Ю. Т. е! а!., 1982. Магоге 29й, 447.) белка Е. со1!. Несмотря на совершенно различные аминокислотные последовательности, эти белки обладают очень схожей вторичной и третичной структурой на участках, ответственных за связывание с ДНК. В каждом из этих белков имеются два соседних ц-спиральных участка, расположенные в пространстве один над другим и образуюпгие область структуры, непосредственно связываюшуюся с ДНК. Часть этой структурной области точно входит в большую бороздку В-формы ДНК.
Относительное расположение аминокислотных остатков, образующих вышеупомянутые а-спирали в белках Сто и с1, показано на рис. 15.19, А. Положение этих м-спиралей в общей пространственной структуре белков показано на рис. !5.19„ Б. Аминокислотные остатки вблизи Х- концов обеих и-спиралей образую~ кон- 194 Опероны биосинтеза аминокислот При обсуждении регуляции фага Х мы видели, что контроль транскрипции некоторых генов может осуществляться с помощью позитивной регуляции, основанной на антитерминации.
Белки )ч) и О действуют на РНК-полимеразу таким образом, что она оказывается способной продолжать транскрипцию, минуя определенные терминаторные последовательности, которые в отсутствие этих белков останавливают транскрипцию. Ре~уляция экспрессии генов с помощью антитерминации также является характерной особенностью функционирования бактериального генома. Наиболее интенсивно антитерминация была изучена на примере организации ряда оперонов биосинтеза аминокислот в нескольких видах бактерий.
Эти исследования также значительно расширили наши представления о природе самого процесса терминации. Оказалось, что в этих оперонах антитерминация происходит при участии рибосом. Это открытие выявило тесную связь между процессами транскрипции и трансляции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
