Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Фенотицическое проявление гетерозиготных конститутивных му- таций в частичных диплоидах, характеризующихся также гетероэиготностью по мутации в гене (3-гапахтозидазы Феиптип Генотип ГО+У !'О"2' Индуцибельный контроль синтеза 13-галпктозидазы 1 0+~х 1+0+2 Индуцибельиый контроль синтеза б-галахтозидизы !'0'Х 1+0+2+ !тО'Х+ !'0~2 Иидуцибельный контроль синтеза б-галактозидазы Конститутивный синтез б-гаиактозидазы Генетический анализ системы утилизации лактозы клетками Е.со!1, осуществленный Франсуа Жакобом и Жаком Моно, можно назвать важнейшим шагом на пути к пониманию механизмов регуляции бактериальных генов.
На базе э~ого исследования была впервые сформулирована модель структурно-функциональной организации оперона. Для утилизации лактозы клетке необходимы продукты двух тесно сцепленных цистронов. Это ген !асУ ', кодирующий )3-галактозидазу (рис, 15.1), и ген !асу', кодирующий пермеазу, которая обеспечивает активньгй транспорт лактозы в клетку. Третий ген 1асА+, кодирующий фермент тиогалактозидтрансацетилазу, регулируется координированно с генами !асУ+ и !асу~, но не имеет непосредственного отношения к утилизации лактозы. Эти гены картируются в последовательности г. — У-А.
Синхронная индукция всех трех белков реализуется через синтез одной общей полицистронной мРНК. Обычно в отсутствие индуктора уровень транскрипции генов !ас очень невелик и в клетке имеются лишь очень малые количества )3-галактозидазы и пермеазы. В то же время удается легко отобрать мутанты (так называемые конститутивные мутанты), которые и в отсутствие индуктора продуцируют большие количества этих белков, такие же, как нормальные клетки в условиях индукции. Все эти конститутивные мутанты содержат мутации вблизи гена е.
и на достаточном удалении от генов У и А. Как показал комплементационный анализ, такие мутанты можно разбить на два класса: 1 (неиндуцибельные) и 0' (операторно-конститутивные). С использованием элементов Р'1ас или конъюгативных мерозигот (см. гл. 8) можно получить частичные диплоиды, включающие такие мутации. Фенотипическне проявления частичных диплоидов этого типа свидетельствуют, что мутации 1 и 0' оказывают принципиально различное влияние на синтез (3-галактозидазы.
Из перечисленных в таблице 155 частичных диплоидов два первых характеризуются нормальным индуцибельным фенотипом, что указывает на рецессивный характер мутации 1 . Ген 1' осуществляет нормальный контроль экспрессии гена У' в случае обоих частично диплоиднь1х генотипов независимо от того, находится ли ген У т на той же хромосоме, что и 1", или на другой.
В случае двух по- Экспрессия гепептического маптериалт следних частичных днплоидов (табл. 15.1), н как му тный О' так н нормальный О' гены оказывают влиян ько на г У', рас положенный на той же самой хромосоме. (В лучае г рят, чтг гены действуют только в цис-положении, а му в таких ах частя называют цис-доминантными.) Если на хро несущ ген У+ присутс~вуе~ ген О ', то наблюдается индуц й спите галакто. зидазы, однако, если вместо него прнсутству ', спите ерментя оказывается конститутивным. Для объяснения этих наблюдений Жакоб в 196! ыдвину. ли предположение о том, что транскрипция , У и А аходится под контролем регуляторного участка, назва ерапторо ген О ') Они также предположили, что регуляция тра ни на о аторном участке осуществляется репрессором, продукт 1'.
Дл епрессо. ра были постулированы две функции. Олн их — это зывание с оператором, подавляющее транскрипцию. -связы ие с инлуктором. Авторы гипотезы предположили, зывание прессора Промотор Р Оператор О' Структурный ген Ген б т„ынтоз.д Х мрих не образуется Молекулы ренрессора РО' ррр р.
р Н-Ганактозндаза ф ° в лес Нзыктнанронинзый ренрессор Перм еаза Молекулы нндунтора прилегающим к операторной области. Б. Индуктор связывается с репрессором, инак- тивируя его, что дает возможность РНК-по. лимеразе связаться с промотором и начать транскрипцию. рис. !5б. Взаимодействие репрессора, иплук тора и оператора пря регуляции транскрипции генов лактозного оперода Е. сой А. В отсутствие индуктора репрессор связывается с оператором, тем самым препятствуя связыванию РНК-полимеразы с промотором, апротив, ие тол этом с тации мосоме, ибельны ет ген О и Моно генов 2 нного оп нскрипц ом гена а из н Другая что свя Ген пермеазы у тан ен ово ген ей з )3- зф г.
в н м( пер я р свя ван ре Ген А 175 с молекулой иидуктора вызывает диссоциацию комплекса репрессор— оператор и тем самым делает возможной транскрипцию (рис. 15.6). Таким образом, гены г,, У и А вместе с промоторным и операторным участками, контролирующими их транскрипцию, образуют так называемый оперон. Под этим понятием подразумевают набор примыкающих друг к другу генов, находящихся под контролем общего репрессора, действие которого регулируется с помощью связывания с молекулами индуктора или эффектора.
Эта гипотеза объясняет как рецессивный характер мутаций 1, так и т)ис-действие гена О (см. рис. 15.7 и 15.8). Рецессивное проявление мутации 1 в частичном диплоиде, содержащем ген 1 ', объясняется просто тем, что ген 1 ' поставляет достаточное количество молекул репрессора для связывания с обоими операторными участками и обеспечения индуцибельности синтеза (3-галактозидазы. С другой стороны, присутствие аллелей О' и О + в частичном диплоиде отражается на контроле транскрипции гена ()-галактозидазы, расположенного только на той же самой хромосоме. В отличие от гена 1 функционирование гена О не связано с образованием каких-либо свободно перемещающихся внутри клетки продуктов. Дополнительные свидетельства в пользу оперонной теории были получены благодаря открытию «полярных» мутаций. Было обнаружено, что нолвелве (атпЬег)-мутации в гене У, приводящие, естественно, к утрате р-галактозидазной активности, часто проявляются и в исчезновении пермеазной и трансацетилазной активности в клетках с генотипом У+А '.
1т1онтенве-мутации в гене У, лишающие клетку пермеазной активности, тоже часто приводят к подавлению трансацетилазной активности в клетках с генотипом А '. И в то же время эти мутации никак не 15. Регулят1ил экспрессии генов у прокариот Мутантный ° .Ф неыетпепый репрессор Рис. 15.7.
Доминантность гена 1+. В частично диплоидных клетках 1 11 геи 1+ обеспечивает достаточно высокую продукцию активного репрессора Лля связывания с операторами иа обеих хромосомах, тем самым предотвраптая транскрипцию обоих лак- тозных оперонов. Поэтому в таких ча- стичных диплоилах синтез (1-галактозилазы скорее иилуцибельный, чем конститутивный. 176 Мутация в операторе ж Р О Мутантная хромосома ! Конститутивный синтез всех белковых продуктов оперона ЙЙЙф~~~ Й Й'~ ~ Йф~~ ОООО оо задет ддд оОооо ОО ° Э ° Ф йй Репрессор Мутантиае хромосома РО Конститутивный синтез всех белковых продуктов оперона ЙЙЙ~Щ Й Й ~ ~ Йф~~ ОП д дД ООО дд О Реорессор Нормальнеа хромосома Р О' Й Ф~Ф мРНК не образуется ее ее Репрессор Рис.
15.8. Цнс-действие аллелей гена 0 объясняется вяиянием только на собствен- ную хромосому. Ген 0 в отличие от гена 1 не кодирует никакого продукта, который мог бы свободно перемещаться внутри клет- ки и взаимодействовать с другой хромосо- мой. А. В гаплоидных клетках, содержащих мутантный оператор 0', не происходит связывания репрессора, вследствие чего про- исходит свободная транскрипция с приле- 3$~ ° ФФ Экспрессия генещического магпериала тающего к оператору 0' промотора. Б.
В ге- терозиготном частичном днплонде (О 10') ген О' проявляется как доминантный. В от- сутствие ицлуктора транскрипция происходит на хромосоме, содержащей 0', но не на хро- мосоме, содержащей 0 +. Фенотипическим проявлением как гаплоидных, так и частично диплоидцых клеток, несущих мутантный ген О', является конститутивный синтез фермен- та. 15. Регуляция экспрессии генов у прокариот сказываются на б-галактозидазиой активности.
Такой полярный эффект попэепэе-мутаций, согласно представлениям Жакоба и Моно, указывает на то, что транскрипция и трансляция полицистронной мРНК происходят в направлении л, — у — А, а единственный промоторный участок находится слева от гена Х. Полярное влияние попвепэе-мутацнй часто наблюдается для оперонов, транскрибируемых с образованием полицистронных мРНК. Механизм реализации полярного влияния попэепэе-мутаций в одном гене на экспрессию примыкающих к нему генов дикого типа будет рассмотрен нами несколько позже. На сегодняшний день оперонная теория получила весьма детальное экспериментальное подтверждение.
Удалось выделить репрессор в чистом виде н показать, таким образом, что он действительно имеет белковую природу. Была определена аминокислотная последовательность белка-репрессора, которая, как оказалось, полностью совпадает с последовательностью, предсказанной на основании определения нуклеотндной последовательности гена 1. Была также установлена нуклеотидная последовательность регуляторных участков !ас-оперона, промоторного и операторного (рис. 15.9), локализованы мутации в этих участках.
Показано, что очищенный репрессор в отсутствие индуктора действительно связывается с изолированным операторным фрагментом ДНК. Репрессор также связывается с индуктором, при этом происходит аллостерическое изменение его пространственной структуры, приводящее к значительному ослаблению связи репрессора с операторной областью ДНК. На примере 1ас-репрессора, как на модели, было изучено такое важное,явление, как специфическое связывание регуляторного белка с регуляторной областью ДНК. Этот феномен лежит в основе практически всех систем контроля экспрессии генов. Из всей ДНК Е,со!й состоящей из 3,2! Ов п.
н., !ас-репрессор узнает и прочно связывается только с одной операторной последовательностью, имеющей длину лишь 24 п.н. (рис. 15.10). Операторная последовательность включает симметричный палиндромный участок протяженностью 1б п.и. Палнндромными называют последовательности, которые по каждой из цепей (с соблюдением полярности) считываются одинаково как слева направо, так и справа налево. Активный !ас-репрессор представляет собой тетрамер, построенный из четырех идентичных полипептидных цепей, кодируемых геном 1ас1.
Каждая цепь содержит 360 аминокислотных остатков. Реализация двух аспектов функционирования репрессора — связывание с ДНК и связывание с индуктором †определяет двумя различными участками структуры цепи. В связывании тетрамерного репрессора с ДНК основную роль играет Х-концевая последовательность, содержащая около 50 аминокислотных остатков. Каждая из двух частей операторного палиндрома связывается с одной из четырех субьединиц тетрамерного репрессора. Взаимодействие с репрессором является кооперативным †связыван одной субъеднннцы усиливает связывание другой. Расположение обеих пар, образуемых четырьмя субъединнцами репрессора, характеризуется симметрией второго порядка.
Таким образом, каждая пара может кооперативно связываться с палиндромным участком (рис. 15.10). Генетические свидетельства в пользу кооперативного характера связывания репрессора были получены при изучении некоторых мута- Хромосома есня Ган! Онарате Защннматся Ган 2 САР саят П онзр и ) ! Ц. Л,.~ ! з 2л2лллсгсссслстслссссллсссллттллтстслсттлсстслстслттлссчлсссслссстттлслстттлтссттгсссстсстлтсттстстссллттстслсссслтллсллтттслслслсслллслсстлтслсслтсз. з сстттссгссстслстссссттссстгллттлслсгсллтсслстслстллтсссгсссстссслллтстслллтлссллссссслсглтлсллслслгсттллслстсссстлттсттлллсттзтстсстттстсслтлстглтлгз. 1 ! Т Пааяаланатвльность -и -за -и -и и +Ю в за ва дни даяаннн л т 2ЗВ 2 во т л — зя..в з хвмв л л т т вн зз Ввззз 22 Вззз З 525 Рис. 15.9.
Нуклеотидная последовательность регуляторной области 1ас-оперона Е. соИ. По из- вестной аминокислотной посчедовательносгн репрессора и )1-галактозидазы можно идентифи- цировать кодируюшие участки генов ! и х. Идентификация операторного и промоторного участков основана на локализации посчедовательностей, которые зашззшаются от фермента- тнвной деградации при связывании с резтрессором и РНК-полимеразой соответственно. Деле- ции или точечные мутации, изменяющие ту или иную функцию, локализуются в опреде- ленных участках последовательности, что позволяет провести дальнейшее соотнесение структуры и функций.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
