Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 34
Текст из файла (страница 34)
В месте разрыва инициируется репарационный синтез ДНК, при этом происходит вытеснение одной цепи, которая в итоге вступает во взаимодействие с комплементарной ей цепью ДНК другого партнера. Сопряженное протекание репарационного синтеза одной цепи в двойной спирали ДНК «донора» и деградация соответствующей цепи в ДНК «реципиента» приводят к возникновению структуры Холлидея, содержащей гетеродуплексный участок только в реципиентной ДНК. Модель Мезелсона -Рэддинга в сочетании с представлением о статистической репарации неправильных нуклеотидных пар может объяснить большинство результатов, полученных при изучении генной конверсии и анализе аберрантного расщепления у грибов. Модель двухцепочечного разрыва-репарации (рис.
14.12) предполагает образование разрыва в обеих цепях с выступающими одноцепочечными концами в молекуле ДНК одного из партнеров. Оба выступающих конца внедряются в двойную спираль ДНК другого партнера. Репарационный синтез в обоих партнерах приводит к образованию асимметрических гетеродуплексных участков в реципиенпюй спирали.
Разрыв в структуре донора закрывается, при этом содержавшаяся на его месте информация полностью замещается на ту, что содержится в соответствующей области ДНК реципиента. Образуются сразу две структуры Холлидея, разрешение которых может привести (как и в случае единичной структуры Холлидея) к возникновению конструкций, как рекомбинантных, так и нерекомбинантных по фланкирующим маркерам.
Настоящая модель способна объяснить не только ряд уникальных наблюдений, сделанных при изучении рекомбинации у дрожжей, но также и те явления, которые с равным успехом интерпретируются в рамках модели М езелсона — Рэддинга. Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. сой, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки.
В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую 152 Экспрессия генетического материала гаг(52, необходимого также для нормального протекания мейоза и репарации двухцепочечных разрывов, вызванных облучением. Таким образом, представляется весьма вероятным, что рекомбинация при мейозе действительно может начинаться с возникновения двухцепочечного разрыва. Наконец, при изучении с помощью электронной микроскопии дрожжевой ДНК, выделенной из клеток на стадии мейотического деления, было обнаружено, что сочлененные молекулы ДНК соединены между собой не в одной точке, как это было показано на рис.
14.5 для плазмид Е. соН, а в двух, расположенных на расстоянии 100 — 1000 п.н. друг от друга. Если такие структуры действительно представляют собой интермедиаты, возникающие в ходе рекомбинации, то это скорее подтверждает модель «двухцепочечный разрыв — репарация», чем модель Мезелсона- Рэддинга. Сайт-специфическая и незаконная рекомбинация Для рекомбинации между молекулами ДНК, которые характеризуются низким уровнем или даже полным отсутствием гомологии, используются механизмы, совершенно отличные от механизмов общей рекомбинации. С сайт-специфической рекомбинацней мы уже встречались на примере интеграции профагов (гл.
7), а с незаконной рекомбинацией — при знакомстве с подвижными генетическими элементами (гл. 8). У Е сой протекание как сайт-специфической, так и незаконной рекомбинации не зависит от генов гесА, гесВ или гесС. Различия между этими двумя типами рекомбинации выражены не очень четко и связаны со степенью сходства нуклеотидных последовательностей, участвующих в рекомбинации. В случае умеренных бактериофагов типа Х участки апР и апВ характеризуются очень высокой специфичностью в отношении связывания специализированных белков, направляющих рекомбинацию, которые кодируются фаговыми генами (пс и хаь Поэтому интеграция профага практически всегда происходит в участке апВ, локализованном в хромосоме Е. сой между генами да! и (По. Однако при делеции сайта апВ интеграция профага все же происходит с заметной, хотя и значительно более низкой частотой, в целый ряд других участков на хромосоме Е.
соИ. Подвижные генетические элементы характеризуются существенными различиями в уровне специфичности при выборе мишени для транспозиции. Поскольку для этих типов рекомбинации степень сайт-специфичности варьирует в широких пределах, для классификации процессов рекомбинации, отличных от общей рекомбинации, можно опираться на более характерные признаки. Отличают рекомбинационные процессы, связанные или не связанные с репликацией ДНК. Так, интеграция профага — это консервативный процесс, в котором формирование рекомбинантных структур происходит при участии только заранее образовавшихся молекул ДНК.
С другой стороны, считается, что для осуществления большинства транспозиционных событий требуется репликация ДНК. 14. Рекамбинация 153 Интеграция и эксцизия профага Х РОР' !л! М! с 111 !Ч с1 ах Рх Рис. !4.13. Транскрипция области Ви-хц генома фага Х контролируется двумя различными промоторами. Прв лизогенизации образуется толь- ко интеграза, необходимая для встраивания фаговой ДНК в хромо- сому Е сей При этом белок с сП активирует транскрипцию гена !л! с промотора р1, расположенного внут- ри гена хи. В ходе индукции профа- га транскрипция обоих генов гл! в хц инициируется с промотора йц Синтезируются одновременно и инте- граза, и эксцизвоваза, необходимые для вырезания фага из хромосомы.
Процессы интеграции и эксцизии профага Х являют собой наиболее изученные примеры сайт-специфической рекомбинации. Интеграция направляется белком интегразой, продуктом фагового гена !лг, при участии клеточного белка, роль которого в этом процессе до конца не изучена (см. рис. 7.8). При рекомбинации между фа!овым апР-сайтом РОР' и хозяйским хромосомным ацВ-сайтом ВОВ' образуются два рекомбинантных сайта ВОР' и РОВ' слева и справа от встроенной ДНК профага.
Индуцируемая эксцизия (вырезание) профага осуществляется посредством рекомбинации между сайтами РОВ' и ВОР' с восстановлением исходных сайтов РОР' и ВОВ'. Процесс эксцизии не является простым обращением интегративной рекомбинации. Он затрагивает иные ДНК-субстраты и протекает при участии как интегразы, так и другого фагового белка (эксцизионазы), продукта гена хй. В фаговом геноме сайт РОР' и гены !л! и х!з примыкают друг к другу, образуя своего рода обособленную функциональную единицу, ответственную за сайт-специфическую рекомбинацию. Транскрипция генов га! и х!з находится под контролем двух различных праматоров.
Один из них расположен вне вышеупомянутой структурно-функциональной единицы, что обеспечивает согласование инициации рекомбинационных процессов с определенными этапами в жизненном цикле фага. На начальной стадии инфекции фагом Х транскрипция гена !л! активируется регуляторным белком сП. При его участии РНК-полимераза может считывать !л! с промотора рг, локализованного внутри гена хеь Благодаря этому экспрессируется только ген !л! и образуется интеграза, обеспечивающая встраивание инфицирующего фага в сайт ВОВ' на хромосоме клетки-хозяина (рис.
14.13). С другой стороны, когда в лизогенной 154 Экспрессия генетического материала клетке происходит индукция профага, транскрипция генов (пс и хЬ происходит с общего промотора рс. Нарабатываются белки, продукты генов !пс и хЬ, которые направляют рекомбинационную эксцизию профага из хозяйской хромосомы. (Вся совокупность этих и других явлений, составляющих основу жизненного цикла фага Х, будет специально разобрана в гл. !5.) Пониманию деталей молекулярного механизма (пс-зависимой рекомбинации способствовало изучение этого процесса !и ч!1го, а также установление первичной структуры участков РОР' и ВОВ' и рекомбинантных участков ВОР' и РОВ'.
Все эти участки характеризуются наличием общего центрального фрагмента (кора, от англ. соте — сердцевина) протяженностью 15 п.н., на котором и разыгрываются основные рекомбинациониые события (рис. 14.14). Каждое из плеч (Р, Р', В и В') характеризуется особой, отличной от других плеч нуклеотидной последовательностью. Функциональное значение этих участков послеловательности исследовали в рекомбинационной системе !и ч!1го, содержащей очищенную интегразу и необходимые клеточные белки. В этой системе можно наблюдать рекомбинацию участков РОР и ВОВ', встроенных в сверхскрученную ДНК плазмиды рВВЗ22, с помощью методов, обсуждавшихся в гл.
9. С использованием клонированных фрагментов, содержащих делеции разной величины в том или ином из плеч Р, Р', В и В', удается определить необходимый для рекомбинации минимальный размер функциональных участков, окружающих общую кор-последовательность.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
