Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 31

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 31)

Рекомбинация Рис. 14.4. Белок КесА принимает участие в двух последова- тельных этапах перено- са цепей при образова- нии структуры Холли- дея. Этап 1: перенос одной из цепей двухце- почечной ДНК к ком- плементарному участку другой молекулы ДНК, содержащему разрыв в гомологнч- ной цепи. Этап 2: ре- цнпрокиый перенос це- пи с образованием области перекреста, ко- торая может переме- щаться вдоль двухце- почечных участков ДНК обоих партг3еров. 5' 3' 3' общей рекомбинации у Е. со(1.

Очищенный белок способен направлять все основные этапы образования структур Холлидея ш »11го. Молекулы белка КесА связываются как с двухцепочечными, так и с одноцепочечными молекулами ДНК и, используя энергию гидролиза АТР, могут расплетать двойную спираль ДНК. Благодаря этому оказывается возможным взаимодействие комплементарных цепей различных молекул ДНК, участвующих в рекомбинации. Эта функция белка КесА обеспечивает осуществление процесса конъюгации (синапсиса) молекул ДНК с гомологичными нуклеотидными последовательностями (см. рис.

!4.4, этап 1). Белок КесА катализирует также последующую переориентацию цепей с образованием крестообразной структуры Холлидея и дальнейшим перемещением области перекреста (рис. 14.4, этап 2). Удобной моделью для изучения рекомбинации (п чг«о могут служить присутствующие в клетках Е. сей небольшие кольцевые молекулы плазмидных ДНК. При электронном микроскопировании очищенных препаратов ДНК плазмиды Со!Е1 видно, что они содержат преимущественно кольцевые молекулы единичной длины, то есть мономеры. Однако удается обнаружить и некоторое количество молекул ДНК, имеющих форму восьмерки, в которой две мономерные плазмиды соединены в одной точке пересечения. Плазмида Со1Е1 содержит один сайт узнавания для рестриктазы Есой1.

Расщепление «восьмерок» этой рестриктазой приводит к образованию двух нзомерных форм, напоминающих структуры Холлидея (рис. 14.5). При этом, как видно из рис. 14.5, образуются по две пары плеч одинаковой длины, что указывает на то, что вышеупомянутые «восьмерки» действительно состоят из двух одинаковых плазмидных молекул, соединенных между собой крестообразной перемычкой. В плазмидных препаратах, полученных из штаммов Е.

сой гесА, «восьмерки» не образуются. Это означает, что они, по всей видимости, представляют собой промежуточные структуры, возникающие в ходе гесА+-зависимой рекомбинации между плазмидами. В то же время эти промежуточные структуры присутствуют в препаратах ДНК из 138 штаммов Е. сой гесВ или гесС . То есть можно предположить, что продукты этих двух генов участвуют в рекомбинационном акте после белка КесА. В действительности гены гесВе и гесС+ кодируют две субъединицы АТР-зависимой нуклеазы. Эта нуклеаза, вероятно, выступает в роли фермента, специфически разрезающего (разрешающего) структуру Холлидея для завершения процесса рекомбинации.

Белок КесА играет также ключевую роль в репарации повреждений ДНК, вызванных воздействием ультрафиолетовых лучей или некоторых химических агентов на клетки Е. сой. Активация такой репарационной функции происходит при взаимодействии с одноцепочечными участками ДНК, образование которых непосредственно связано с повреждениями в молекуле ДНК. Белок КесА обладает протеолитической активностью„ стимулируемой одноцепочечными ДНК.

Эта протеолит.ическая активность проявляется в расщеплении по крайней мере двух типов белков- Рнс. !4.5. Полученная с помощью электрон- ного микроскопа фотография структуры Холлидея, образующейся прн рекомбинации кольцевых плазмндных ДНК в Е. соН. Коль- цевые молекулы липеариэованы при расщеп- лении рестрнктаэой Есо К) (данная плазмнда содержит только один участок расщепления Экспрессия генетического материала рестриктаэой ЕсоИ).

Дяе изображенные структуры являются иэомерными формами структуры Холлндся. На правой фотографии вилна область расхождения олноцспочечных участков. (По Ропег Н., Юезг!ег О., ~956. Ргос. Ыаь Асад, Яс(. ()ЕА, 73, 3000.) 14. Рекомбииация репрессоров. Одиы из них †э репрессор фага г» расщепление которого приводит к индукции профага. Другой гесА-чувствительный репрессор является продуктом гена )ехА. Этот репрессор вовлечен в регуляцию уровня экспрессии гена гесА и ряда других генов, отвечающих за репарацию ДНК и другие, так называемые $05-функции, способствующие выживанию клетки в экстремальных условиях. В норме репрессор 1ехА обеспечивает лишь невысокий уровень экспрессии гена гесА, достаточный для обеспечения процессов общей рекомбинации. Однако при поврежлении ДНК, угрожающем жизни клетки, стимулируется протеолитическая активность белка ВесА и происходит расщепление репрессора 1ехА.

Это приводит к индукции генов иег (они обсуждались в гл. 13) и других генов, связанных с репарацией ДНК и восстаыовлением нормальной жизнедеятельности клетки. Белок ВесА в условиях его повышенной продукции, вероятно, непосредственно участвует в репарации, направляя рекомбинацию между поврежденными н неповрежденными участками дочерних молекул ДНК после репликации. Рассмотренные в этом разделе экспериментальные наблюдения позволяют сделать вывод о том, что образование структур Холлидея является промежуточным этапом в процессе рекомбинации у Е.

сой. Формирование и разрешение структур этого типа находится под генетическим контролем. Модель Холлидея была изначально предложена им для интерпретации данных по рекомбинации при мейотическом делении, т, е, для эукариот. Применимость этой модели и для прокариот позволяет считать, что основные механизмы рекомбинации, характерные для прокариот и эукариот, очень схожи. Сейчас мы перейдем к рассмотрению доказательств реального существования структур Хозшндея, а также данных, позволяющих представить процесс образования таких структур у эукариот.

Высокая отрицательная интерференция и генная конверсия Анализ частот возникновения рекомбинантных генотипов при трехфакторном скрещивании дает дополнительное (хотя и косвенное) подтверждение тому, что процесс рекомбинации сопровождается образованием гетеродуплексных участков ДНК. Впервые это было отмечено при изучении явления высокой отрицательной интерференции при скрещиваниях с участием очень тесно сцепленных генетических маркеров. Понятие «интерференция» (1), введенное нами в гл. 5, определяется формулой 1 = 1 — с, где с —.коэффициент совпадения (коинциденции), т, е, отношение числа наблюдаемых двойных перекрестов к числу ожидаемых, при трехфакторном скрещивании. В большинстве случаев при скрещиваниях с участием маркеров в трех различыых сцепленных генах (х — у — е) оказывается, что образование перекреста между х и у снижает вероятность образования второго перекреста в интервале между у и г.

То есть в таких скрещиваниях величина с меньше 1, а 1 соответствеыыо положительное число, отражающее наблюдаемую величину интерференции (см. гл. 5). Рекомбинация очень тесно сцепленных маркеров как в прокариотических, так и в эукариотических организмах, как правило, характери- 140 Экспрессия генетического материала 90 8О 70 60 50 зо ш о 2 4 6 8 1О 12 14 16 18 Я,е Я,1%) Рнс. 14.6. Коэффициент коннцнденцнн с является функцией суммы частот рекомбинации Я 1 н К между маркерами фага х в серии различных трехфакторных скрезцнваннй (обнасзь рекомбинации отмечена). (По Атац Р„Мезейон М., 1965. Оепес)сз, 51, 369,) зуется значениями с, значительно болыпими 1. Это явление, характеризуемое отрицательными значениями величины 1, называют высокой отрицательной интерференцией.

Иначе говоря, вероятность двойного кроссинговера оказывается значительно выше ожидаемой. В этом можно убедиться на ряде примеров (приведенных в гл. 7 и 8), отражающих данные по генетическому картированию, которое проводилось для некоторых фагов и бактерий.

Высокая отрицательная интерференция (иногда называемая также локализованной отрицательной интерференцией) наблюдается, например, в ряде трехфакторных скрещиваний между мутантами фага )с Значения с для каждого скрещивания представлены на графике (рис. 14.6) в форме зависимости от суммы частот рекомбинации в двух интервалах для каждой пары из трех использованных мутантов. При Кз+йз<0,01 наблюдаемое значение с для внешних маркеров превышает 70, что соответствует высоким отрицательным значениям К Четырех- или пятифакторное скрешиванне позволяет наблюдать тройные и четверные перекресты.

При этом также обнаруживается„что тройные и четверные обмены имеют место чаще, чем можно было бы ожидать, полагая, что они происходят независимо друг от друга. Достаточно наивная и, как стало ясно впоследствии, неверная интерпретация этих наблюдений сводилась к предположению, что на небольших участках ДНК двойные перекресты возникают чаще, чем можно ожидать на основании данных о частоте кроссинговера для каждой пары генетических маркеров. Сегодня мы понимаем, что явление высокой отрицательной интерференции в действительности связано не с возникновением множественных кроссинговеров на небольших участках хромосомы, как можно было бы полагать, исходя из определения интерференции.

Характеристики

Список файлов книги