Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 30
Текст из файла (страница 30)
При этом происходит размыкание водородных связей между комплементарными основаниями внутри одной родительской молекулы ДНК и замыкание соответствующих связей между основаниями цепей из различных родительских молекул ДНК. Этот процесс может приводить к образованию протяженных гетеродуплексных участков в обеих родительских молекулах ДНК (рис. 14.1,Д). Благодаря возникновению гетеродуплексов обеспечивается высокая точность взаимодействия гомологичных участков ДНК. Образование ~акой крестообразной структуры, или структуры Холлидея, было впервые предсказано в 1964 г.
Робином Холлидеем, исходя из генетических данных по изучению генной конверсии (этот процесс рассмотрен ниже). Структуру Холлндея можно изобразить так, как показано на рис. !4.1,Е. Вращение такой структуры вокруг точки перекреста може~ приводить к образованию другой изомерной формы (рис. ! 4.1, Ж, 3). При разрезании структуры двумя возможными способами (рис. 14.1, И вЂ” Л) могут вновь возникать линейные молекулы ДНК различного типа. При разрезании по вертикальной оси образуются линейные молекулы, рекомбинантпые по родительским генетическим маркерам, расположенным по обе стороны от гетеродуплексного участка ДНК. При разрезании по горизонтальной оси две образовавшиеся молекулы ДНК не будут рекомбинантиыми по родительским маркерам, фланкирующим область перекреста, но обе будут содержать по гетеродуплексному участку.
Современные представления о механизме общей рекомбинации, отраженные на рис. !4.1, являются результатом многолетних генетических и биохимических исследований этого процесса как у прокариотических, так и у эукариотических организмов. Мы вкратце рассмотрим данные, свидетельствующие в пользу рассмотренной модели рекомбинации. Большая часть таких данных была получена при физическом и генетическом изучении молекул ДНК плазмид или бактериофагов.
Ввиду относительно небольшого размера этих молекул при работе с ними довольно легко удается избежать их физического повреждения. Некоторые генетические данные, позволившие предсказать определенные детали механизма рекомбинации, были получены при изучении явлений генной 14. Рекомбинация Б А в ь в а А Ь а в В А ' Ь Ь а А в А а ь Рис. !4Л, Обнгая рекомбинация-модель Холлидея. Обратите внимание, что переме- щение области перекреста может приводить к образованию протяженных участков гете- ролуплексной ДНК. Показаны два варианта промежуточной структуры при рекомбина- ции, отличающиеся поворотом на !80' во- круг вертикальной оси. Возможны два спо- А В А ь соба расщепления структуры креста: один из них приводит к рекомбинации маркероц фланкирующих гетеродуплексную область ДНК, расщепление вторым способом не приводит к рекомбинации.
(По Роцег Н., всем!ег ЬЗ., !97б. Ргос. Ьгаг. Асаг!. Всг. ЫВА, 73, 3000.) Экспрессия генетического материала конверсии у грибов и высокой отрицательной интерференции (о которой также пойдет речь позже) у целого ряда организмов. Кроме того, генетический анализ рекомбинационных процессов у Е. сой позволил выявить и изучить 1п ч!!го ряд важнейших ферментов, участвующих в рекомбинации. Консервативный разрыв и воссоединение Важнейшим допущением в рамках модели, проиллюстрированной на рис. 14.1, является представление об образовании рекомбинантных молекул ДНК за счет разрыва и воссоединения цепей родительских молекул.
Этот процесс происходит независимо от процесса полуконсервативной репликации ДНК. Консервативная природа рекомбинации была впервые выявлена при работе с фагом 1.. Фагн, размножавшиеся в клетках Е со!1, растущих на среде, содержащей тяжелые изотопы азота и углерода — 'э)ч) и 'зС, могут быть легко отделены от фагов, культивируемых на обычной среде, содержащей легкие изотопы '4)ч( и 'зС (рис. !4.2, А). На рис.
14.2, Б показано распределение по плотности фагового потомства, образующегося при инфекции «тяжелыми» фагами (множественность инфекции около !) клеток, растущих на «легкой» среде. Большинство дочерних фатов содержит «легкую» ДНК, состоящую из двух новосннтезированных легких цепей. В небольшой части фигового потомства содержится ДНК, возникшая в результате полуконсервативной репликации родительской ДНК «тяжелых» фагов и состоящая из одной тяжелой и одной легкой цепи. Такие фаговые частицы характеризуются более высокой плотностью.
На рис, 14.2,В показан характерный профиль распределения по плотности дочерних фагов, образующихся при заражении «легких» клеток «тяжелыми» фаговыми частицами с высокой множественностью инфекции ( - 20 фатов на клетку). В этом случае некоторые из вошедших в клетку фаговых геномов не успевают реплицироваться, а заново упаковываются в головки, образовавшиеся при созревании фагового потомства. Эти нереплицнрованные геномы можно идентифицировать в виде третьего, самого тяжелого пика при фракционировании смеси дочерних фагов, Изучение фагового потомства, образовавшегося прн одновременной множественной инфекции клеток, растущих на легкой среде, тяжелыми фатами с двумя различными генотипами а + и + Ь, показало, что некоторые фаговые частицы с нереплицированным геномом характеризуются рекомбинантным генотипом +~+ (рис.
14.2,Г). Это означает, что рекомбинация родительских геномов может происходить независимо от репликации ДНК. На рис, 14.1 похазано, что образование рекомбинантных молекул ДНК за счет разрыва и воссоединения цепей сопровождается возникновением гетеродуплексного участка ДНК. Образование таких гетеродуплексов не обязательно связано с последующим «разрезанием» структуры Холлндея, которое приводит к рекомбинации фланкирующих генетических маркеров.
Генетическим свидетельством образования гетеродуплексных молекул ДНК является факт существования гетерозиготных фагов г„ которые при инфекции с множественностью 1 фаг на 135 14. Рекомбилпцил Титр фага (логарнфмлческая шкала) 1.1. 1.Н Платность -+ А ьн нн 3Л. 1.Н НН клетку дают потомство с двумя сегрегированными аллелями. В опыте, аналогичном тому, который представлен на рис.
14.2,Г, тяжелые родительские фаги были представлены генотипами 2с+ и Хс, а среди потомства обнаруживались гетерознготные фаги с+/с. Такие фаговые частицы образуют крапчатые негативные колонии (бляшки), состоящие из прозрачных и мутных участков, которые легко отличить как от прозрачных бляшек, характерных для Хс, так и от мутных, образуемых ).с+ (рис.
!4.3, А). Распределение по плотности фаговых частиц, образующих крапчатые, прозрачные и мутные бляшки, представлено на рис. 14.3,Б. . Гетерозиготные фаговые геномы г)г' должны иметь структуру, схематически показанную на рнс. 14.3,В. Молекулы ДНК этих фагов содержат пары некомплементарных оснований, которые были незамечеиы системой репарации клетки и поэтому сохранились в составе ДНК зрелых фаговых частиц. 8 Рис. 14.2. А. Разделение фаговых частиц (фага Х), состоящих целиком из легких ((,(.) и целиком из тяжелых (НН) цепей в градиенте плотности раствора СаС1 Содержимое центрнфужной пробирки распрелеляется по фракциям, в каждой из которых с помощью обычного чашечного теста подсчитывают количество фагоных частиц, Б-Г.
Распределение по плотности дочерних фагов, образующих на легкой среде в клетках, инфици- рованпых: Б-целиком тяжелыми фагами с низкой множественностью инфекция, В--целиком тяжелыми фатами с высокой множественностью инфекции. à — целиком тяжелыми фагами двух различных генотипов с высокой множественностью по каждому из них. Профиль распределения фатов с родительским генотипом показан черной, а рекомбинантов дикого типа-цветной линией. 1Зб Прозрачные бляшки (с) Мутные бляшки (с') Кралчатые бляшки (с)с') сН НН с —.)-л»l'»г»» г'»у~.~ » с' Генетический анализ рекомбинации С помощью генетического анализа удалось идентифицировать ферменты, участвующие в процессе общей рекомбинации у Е. со(1. При скрининге мутагенезированных клеток Р методом «отпечатков» можно на исходной чашке обнаружить колонии мутантных клеток, неспособных к образованию рекомбинантов при конъюгации с клетками НК на чашке-реплике.
Оказалось, что мутации, влияющие на способность к рекомбинации, локализуются в трех генах, обозначенных гесА, гесВ и гесС. При изучении таких мутантов удалось идентифицировать функционирующие в нормальных клетках белки, кодируемые каждым из трех генов. Белок КесА представляет собой удивительный полифункциональный фермент, вовлеченный как в общую рекомбинацию, так и в репарацию ДНК. Ген гесА необходим для протекания всех процессов в системе Рнс. 14.3. А.
Фотография чашки Петри, на которой видна морфология негативных колоний (бляшек1 образуемых фаговыыи частицами Хс1 (про. зрачиые), йс1+ (мутные) и гетерози готами йс1' /с1 (крапчатые; показана стрелкой). (Соцтгезу 1)г. Мезе!зоп, Нагсагб ()в|тига)гу.) Б. Распределение по плотности фап)ного потомства, образующегося прн инфекции клеток на легкой среде целиком тяжелыми фатами с генотипами с1 и с1+ при высокой множественности ин- й фекции. В. Структура лн ДНК гетерозиготы Хс1+ 1'с1. и й ае с ел. и Экспрессия генетического материала 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
