Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 25
Текст из файла (страница 25)
ДНК-лн- газа фага Т4 для образования интер- медната (фермент-АМР) вместо нн- котннамидапеннндннуклеотнда предпочтительно использует АТР. 5 !Оэ 2 \Оэ $ ° 5 Ю 0 55 30 45 60 Время (мнн) нрн 42,5" Термннеция Б Иницнецня Эцоипщия ои ре цянкммонньж,), мяне ко Рис. 13.5.
А. Вюзючение 'Н-тимина (черные кружки) и 'еС-лейцина (цветные кружки) в клетки температурочувствительного мутан- та э(ааЕ при рестриктивной температуре. После температурного сдвига до 42,5' синтез ДНК практически немедленно прекрашается, в то время как синтез белка продолжается с нормальной скоростью. Сравните зто с по- ведением клеток температурочувствительного мутанта э(иаА (включение эН-тимина — черные квадратики; включение '4С-лейцина — цветные квадратики), которые в течение 15 мин после повышения температуры до 42,5' продол- жают синтезировать ДНК. (По И'есВНег э'.А., бгояя э'.))., 1971. Мо!ес. Пеп.
Пепе!!05, 113, 273.) Б. На приведенной диаграмме проил- люстрированы различия между процессами инициации и злонгации при репликации хро- мосомы Е. сой, Мутация е)лаЕ затрагивает злонгацию, а мутация э(наА †инициац реп- ликации. 13. Генетический контроль синтеза ДНК Рис. 13.6. Положение генов, вовлеченных в синтез ДНК, на хро- мосоме К сой.
д "С идд аЕ ~-~--т ~-~-, I длаХ дла аг1С йаЯ /- 80 70 аааб Фуккпва Лскус диа С ственной генетической функции. Некоторые мутации такого рода сопровождаются изменениями, затрагивающими уже идентифицированные ферменты. Другие позволяют идентифицировать новые ферменты. Если данная мутация является летальной или условно-летальной, то затрагиваемая ею функция, вероятно, играет важную роль в изучаемом процессе. ро! В ала Е ала Х ила 2 ила 1 дуг А Вд дла 6 дуг В ила А аг) С дла Р ро1А гроВ два В ааь ДНК-полимераза П Субъединица ДНК-полимеразы 1П Субъединица ДНК-полимеразы П! Субъединица ДНК-полимеразы 1П Инициация репликации ДНК Субъединица ДНК-гнразы(топоизомеразы П) ДНК-лигаза Праймазная субъединица праймосомы Субъединица ДНК-гиразы(топоизомеразы П) Инициация репликации ДНК Участок инициации репликации ДНК Инициация репликации ДНК ДНК-полимераза 1 Субъединица РНК-полимеразы Субъединица праймосомы ББВ-белок, связывающийся с одноцепочечиой ДНК Субъединица праймосомы Экспрессия генетического материала Первые указания на то, что в системе репликации ДНК участвует целый ряд важных генетических функций, были получены благодаря выделению широкого набора условно-летальных температурочувствительных мутантов Е.
сод (Ипа ), комплементационный анализ которых позволил соотнести их с мутациями в ряде различных генов. Среди них можно выделить два класса мутантов, которые при рестриктивной температуре; (1) немедленно прекращают синтез ДНК или (2) в течение относительно протяженного временного интервала постепенно прекращают синтезировать ДНК (рис.
13.5). Первый фенотип связан с нарушением процесса синтеза ДНК в реплихативной вилке, а второй — с исчезновением способности инициировать новый цикл репликации хромосомы. (В несннхронизированной культуре индивидуальные клетки мутантов второго класса, находящиеся на различных стадиях репликации, начавшейся еще при пермиссивной температуре, не прекращают синтезировать ДНК после повышения температуры до полного завершения цикла репликации хромосомы.) После сопоставления выделенных мутаций с определенными белками, на которых сказываются зтн мутации, можно начать изучение функциональной роли этих белков ш ч!чо, Локализация генов, ответственных за репликацию ДНК, на хромосоме Е. сой показана на рис.
13.6. Биохимический анализ репликации ДНК В клетках Е. сой содержатся трн различных фермента с ДНК-полимеразной активностью. Среди них наиболее полно изучена представленная в клетке наибольшим числом молекул ДНК-полимераза 1 (Ро! !). Этот фермент способен направлять синтез комллементарной цепи по матричной цепи ДНК при наличии соответствующей комплементарной затравочной цепи со свободной 3'-ОН-группой, связанной водородными связями с матричной цепью.
Полимеризация происходит в направлении 5' — ~ 3' за счет взаимодействия очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата с 3'-ОН группой растущей (затравочной) цепи. Фермент Ро! 1 обладает также 5' — 3'-экзонуклеазной активностью, т.е. способен последовательно отщеплять 5'-нуклеотнцы от цепи ДНК, связанной с матричной цепью. На рис. 13.7 изображена модель структуры ДНК-полимеразы 1 с указанием расположения соответствующих функциональных центров. Особые ферментативные свойства ДНК-полимеразы 1 сделали этот фермент эффективным и весьма распросграиенным инструментом для изучения нуклеиновых кислот (см. Дополнение 13.1).
Фермент Ро! 1 считали единственной ДНК-полимеразой Е, сой до тех пор, пока не была обнаружена мутация (ро!А), подавляющая эту полимеразную активность (не менее чем на 98%), однако не сказывающаяся существенно на способности мутантного штамма к размножению. Благодаря обнаружению мутантного штамма ро1А биохимикам удалось идентифицировать и выделить две другие ДНК-полимеразы, Ро1 П и Ро! П1, которые в обычных штаммах Е. сой вносят небольшой вклад в общую ДНК-полимеразную активность.
!13 Рис. !3.7. Модель ДНК-полнмеразы 1, показывающая распо- ложение функцио- нальных центров фер- мента по отношению к матричной н эатра- вочной целям ДНК, Днк.вовнмараза! Магри цэн 5 3-экэонунвааэнцй венгр трнфоцрагнмй цавтр цэвтр концевого учаспга затравив 3 5-знэанунвваэнцй (норранэвруввцвй) центр Затравочвцй центр Загравочваа цэаь 13. Генетический контроль синтеза ДНК ДНК-полимераза 1 (или Ро11) Е. со!! находит широкое применение в работе с рекомбинантными ДНК н при определении нуклеотидной последовательности ДНК.
Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением радиоактивной метки в ДНК ш чйго с помощью так называемой ник-трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полнмеразной н 5' — 3'-экзонуклеазной активностей. Этот процесс позволяет добиться необычайно высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т. е. получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью (оцениваемой в импульсах в минуту на ! мкгДНК),чем при введении метки !п ч!чо. Радиоактивные ДНК- зонды, полученные с ломошью ник-транс- ляции, могут использоваться при скрининге библиотек рекомбинантных ДНК для обнаружения клонов, содержащих комплементарные последовательности ДНК, или для идентификации соответствующих фрагментов рестрикции ДНК после электрофоретического разделения в геле (см.
гл. 9). В присутствии двухцепочечной ДНК, содержащей одноцепочечный разрыв фосфодиэфирной связи, и меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов ДНК-полимераза 1 направляет одновременно включение радиоактивных предшественников в растущую цель и деградацию немеченой цели ДНК (рис. ! 3.8). Двухцепочечную меченую ДНК затем денатурируют тепловой или щелочной обработкой и получают одноцепочечный зонд. л ~''л«; > Н Н Ро!1 ЕЯТР Ро! ! Е!Чт (1 1„ г Н > Рис. 13.8. Синтез щ тйго радиоактивной цепи ДНК (цветнвя ли- ния) прн действии ДНК-полимеразы Е Совместное действие полнмернзацвонного н экзонуклеазного цен- тров (см.
рнс. ! 3.7) приводит к перемеще- нию одноцепочечного ЗнОН15сРО,-разрыва вокруг показанной на рисунке кольцевой матричной цепи. По- этому данный процесс называется нин-транс- ляцией (т.е. перемеще- нием разрыва). Помимо этого ДНК-полимераза 1 является необходимым компонентом важнейшего метода определения последовательности ДНК, который называют «методом терминвции цепи». Для установления последовательности ДНК, как обсуждалось в гл. 9, необходимо получить серии радиоактивно меченых лерекрывающихся фрагментов, причем в рамках каждой серии все фрагменты должны начинаться с одной обшей точки и статистически распределяться по длине таким образом, чтобы на противоположном конце каждого фрагмента находилось основание одного определенного (для данной серии) типа — А„Т„П или С. В этом методе серии перекрывающихся фрагментов получают с помощью ДНК-полимеразы 1 по одноцепочечной ДНК-матрице с использованием небольшого затравочного олигонуклеотщза (праймера), комплементарного определенному участку матрицы, и радиоактивных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.
Для каждой матрицы проводят четыре независимые реакции полимеризации, при этом каждый раз Экспрессия генетического материала в реакционной смеси содержится некоторая доля одного из четырех дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, встраивание которых вызывает терминацию роста цепи, что обусловлено отсутствием у встроившегося нуклеотида 3'-ОН- группы, необходимой для осуществления следующего этапа элонгации. Например, в реакционной смеси, содержащей дидезоксиаденозинтрифосфат и четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, в каждое положение растущей цепи, соответствующее остатку тимина в матричной цепи, будут конкурентно включаться и дезоксиаденозин, и дндезоксиаденозин. В тех случаях, когда будет происходить включение дидезоксиаденозина, дальнейший рост цепи на данной матрице будет уже невозможен. При включении дезоксиаценозина полимеризация будет продолжаться без помех вплоть до следующего матричного остатка тимина, где вновь с некоторой вероятностью может произойти включение дидезоксиаденозина, приводящее к терминации цепи.
Таким образом может быть получена серия всех Клоннруюший вектор М13 со всювочиой последовательностью Я. сой Из отдельной бляшки полу няп культуру фага, вьщеляют фаговую однояепоючнув ДНК Добавляют затравку, комююмснтарную последовательности М13, щшмыкммяей к всювке ЩбТТР гдбСТР— т б Рис. !3.9. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК с помощью клонирования на фаге М!3 и последующего использования метода терминации цепи с применением фрагмента Кленова ДНК-по- Нагревпот ллн отделснвя наборов ОВрсярмваяягнсхсл фрагментов от матриям. Фракниопнруют фрагменты с помощмо ~ влек трофо рею Блшшси фага М13, несущего вставочную последовательность лимеразы !. Сравните строение обычных де- зоксирибонуклеозидтрифосфатон (д)чТР) и терминирующих дидезоксирибонуклеозид- трифосфатов (д!б)ь!ТР).
1!6 На первый взгляд казалось, что это наблюдение свидетельствует о функциональной заменимости ДНК-полимеразы 1. Однако дальнейшие исследования показали, что мутация ро!А не затрагивает 5'- — 3'-экзонуклеазной активности Ро1 1.
Удалось получить добавочные температурочувствительные мутации гена ро!А, подавляющие 5'— -~ 3'-экзонуклеазную активность и летальные лри рестриктивной температуре. На основании этих данных был сделан вывод о том, что 5' -~ 3'-экзонуклеазная активность Ро! 1 является жизненно важной функцией, необходимой для удаления РНК-затравок при репликации, т.е. для обеспечения нормального синтеза полноценной отстающей цепи ДНК (рис.
13.3). В действительности для исходного ро!А-мутанта было показано, что фрагменты Оказакн встраиваются в протяженные участки цепи ДНК с некоторым запаздыванием, и это свидетельствовало о возможном участии ДНК-лолимеразы 1 в заполнении пустот, возникающих после удаления РНК-затравок из отстающей цепи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
