Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 24
Текст из файла (страница 24)
3'-ОН-группа присоединившегося таким образом нуклеотида в свою очередь выступает в роли затравки для присоединения следующего нуклеотида. Цепи ДНК в предложенной Уотсоном и Криком структуре двойной спирали антипараллельны, то есть в области репликативной вилки присутствуют и 3'- и 5'-концы синтезируемых цепей. Как уже упоминалось, для действия ДНК-полнмеразы необходимо наличие 3'-ОН-затравки, и поэтому только одна из двух растущих цепей ДНК (ведущая цепь) мохсет синтезироваться непрерывно.
Синтез другой (отстающей) цепи идет прерывисто (рис. 13.1, А). Экспериментальные данные, свидетельствующие о прерывистом характере роста в репликативной вилке одной нз целей, были получены с помощью нульсового введения метки Н-тимидина в синтезируемую в клетках ДНК. Если перед экстракцией ДНК из клеток они находились в контакте с радиоактивным субстратом лишь в течение нескольких секунд, то оказывается, что значительная часть новосинтезированной ДНК (идентифицируемой по содержанию радиоактивности) при щелочной денатурации распадается на ряд небольших одноцепочечных фрагментов длиной около 1000 — 2000 нуклеотидов.
Они получили название фрагментов Оказаки, по имени Рейджи Оказаки, впервые обнаружившего эту особенность релликации ДНК. Если пульсовое введение зН-тимидина прерывают перенесением растущих клеток на обычную среду, не содержащую меченых предшественников, и подращивают клетки в течение нескольких минут (метод «»улье-чейз»), то радиоактивность обнаруживается уже в составе весьма протяженных фрагментов ДНК (рис. 13.2), Поначалу тот факт, что «отстающая» цепь ДНК синтезируется не непрерывно, представлялся весьма удивительным, поскольку неясно было, откуда всякий раз берутся новые затравки («праймеры»). Как извест.- но, для работы ДНК-полимеразы необходимо наличие ЗиОН-затравки, без которой фермент не способен направлять рост цепи.
Так, очищенная ДНК-полимераза оказывается абсолютно неактивной в смеси, содержащей кольцевую одноцепочечную ДНК фага фХ174 в качестве матрицы и необходимые субстраты. В то же время, как мы знаем, РНК-полимераза может инициировать синтез РНК по одноцепочечной ДНК-матрице в отсутствие какой бы то ни было затравки. Это свойство РНК-полимеразы подтверждается, как отмечалось в гл.
11, тем, что на 5иконце сннтезируемых молекул РНК содержится трифосфатная группировка. Впоследствии было установлено, что на 5'-конце фрагментов Оказаки находятся участки РНК. Это указывает на участие РНК-лолимеразы в образовании РНК-затравок прн репликации Смпез РНК-затравки ДНКфрзгмекпя Окзиик 5' 3' 5 3' 3' ь 3' 5' 5' Деграазцкя РНК затравки 3 5' 3 5' 3,' 3' мпяммт одиоцз. аочечаиа Разрыв 5' 3' Рис.
(3.!. А. Н репликативной вилке особен- ности синтеза каждой из двух цепей ДНК зависят от полярности цепи. Синтез ведущей цепи в направлении 5'-~Э' происходит неп- рерывно. Для синтеза отстающей цепи с противоположной полярностью необходи- мо постоянное образование новых затра- вочных участков. Б. Отстающая цепь синте- зируется опюсительно небольшимн фрагмен- тами (фрагменты Оказаки), для инициации которых необходимо предварительное обра- зование коротких РНК-затравок (праймеров) Экспрессия генетического материала РНК-затравочный участок одного фрагмента ДНК удаляется после того, как завершается синтез следующего фрагмента.
Разрыв ме- жду двумя фрагментами закрывается благо- даря действию ДНК-лигазы. В. Участие хе- ликазы, ЯБВ-белка, связывающегося с одно- цепочечной ДНК, и топоизомеразы в распле- таиии двойной спирали родительской ДНК при движении репликативной вилки. (По А(бег!я В., Бгетд(апг Я, !977. Р(а!иге, 269, 655.) 107 Содержите раек«активных фрагиьяхав ДНК во фрзкяии 4 5 б 7 8 9 1О 1! !2 13 !4 1 2 3 дяо пробирки Рнс.
13.2. Эксперимент, подтвер- ждающий модель, согласно которой часть новообразованной ДНК Е, сой состоит из небольших одноцепо- чечных фрагментов, которые в даль- нейшем включаются в сосзав протя- женных цепей. Черная кривая отра- жает распределение по размерам одноцепочечных фрагментов ДНК, наблюдаемое при пульсрвом введе- нии метки н воследуюшем центрнфу- гврованнн в сахарозном градиенте плотности при рН !2 для предотвра- щения образования водородных свя- зей между комплементарными цепя- ДНК. Эту РНК-полнмеразу, отличающуюся от ферментов, которые непосредственно участвуют в процессе транскрипции, называют лраймазой.
РНК-затравочные участки не сохраняются в структуре зрелой ДНК. После реализации своей функции для инициации репликации ДНК они удаляются за счет проявления 5' — 3'-экзонуклеазной активности ДНК- полимеразы (рис. 13.!,Б и !3.3). После удаления РНК-затравки и ее замещения на фрагмент ДНК, инициация синтеза которого происходит на следующей РНК-затравке, расположенной ближе к области репликатнвной вилки, между двуМя соседними синтезированными фрагментами ДНК остается разрыв. Этот разрыв (отсутствие ковалентной связи между 3'-ОН- н 5'-РО -концами фрагментов цепи) устраняется при участии фермента — ДНК-лигазы,— направляющего образование фосфодиэфирной связи (рис, 13.4).
Синтез ведущей и отстающей цепей происходит по мере продвижения реплнкатнвной вилки вдоль двойной спирали родительской ДНК (см, рис. 13.!). Процесс расплетания двойной спирали н экспонирования 13. Генетический контроль синтеза ДНК ми. Небольшие фрагменты, содержа- щиеся в пике, расположенном в верхней части центрифужной про- бирки, через некоторое время после удаления из среды радиоактивных предшественников (пернод «чейзь) сказываются включенными в состав п«потяжеяных одноцепочечных участ- ков (цветная линия).
Разделение ос- новано на том, что ббльшне по раз- меру одиоцепочечвые цепи характе- ризуются более высокой скоростью седвментацнн, чем небольшие фраг- менты. 5' 3' — В "' 'й'63)' з' Сюпез РНК-затравки в налравмнви праямезм Преймаза 5' 3' РР'7уй7ИИР аоо ааа ЛНК повимераза П! Присоединение дезакензмпопуклеотидов к РНК-мтрзвке нваравллет ДНК палнме- Раза аао ооо Обмднненве фрвгме~пов Оказакн е помощам ДНК-лигазм аао оаа двух матричных цепей ДНК происходит при участии трех тюзов белков (см.
табл. 13.1) и сопровождается значительными энергетическими затратами. Белок первого типа, хелнказа, осуществляет собственно расплетание спирали, а необходимая для этого энергия поставляется за счет гидролиза АТР. Белок второго типа (ВВВ) специфически связывает- Рнс. 13.3. Синтез отстающей цепи ДНК инициируется праймазой, при действии которой образуются корот- кие РНК-фрагменты, комплемен- тарные соответствующим участкам матричной цепи ДНК.
ЗиОН-концы этих фрагментов выступают в каче- стве затравки для синтеза ДНК, нап- равляемого ДНК-полимеразой Ш. ДНК-полнмераза ! удалнет РНК-зат- равку, начиная с 5икоица. При этом Экспрессия генетического материала 3'-ОН-конец предшествующего фраг- мента цепи ДНК служит затравкой для проявления 5' Зсэкзонуклеазной активности (улаление РНК) н поли- меразной активности (заполнение бреши) ДНК-полимеразы 1. После замены участка РНК на соответ- ствующий участок ДНК между лву- мя соседними фрагментамн цепи ДНК остается разрыв, который за- крывается ДНК-лигазой. 109 Е» 1 = Е-АМР«иикотииемидмоиоиуииеотии(ХМР) ММР АМР ЕАМР+ 3' Р ' Р +ŠΠΠΠΠΠ— Р=О ) Адеиоэии ь АМР О- з' ся с одноцепочечной ДНК, предотвращая преждевременную реассоциацию целей.
Раснлетание двойной спирали родительской ДНК без вращения приводит к образованию дополнительных витков или узлов на участках ДНК впереди репликативной вилки, аналогичных узлам, которые возникают при быстром разъединении скрученных нитей волокна. Белок третьего типа, топоизомераза, способствует релаксации сверх- скрученных участков ДНК, внося одноцепочечные разрывы фосфодиэфирных связей и раскручивая узлы в области родительской двойной спирали перед репликативной вилкой.
После такого раскручивания и снятия напряжения, связанного с образованием дополнительных витков спирали, толоизомераза вновь замыкает разорванные фосфодиэфирные связи и восстанавливает структурную целостность родительской ДНК. Схема действия трех названных белков в процессе репликации представлена на рис. 13.1,В.
Генетический анализ репликации ДНК Генетический анализ, который сыграл весьма существенную роль в изучении знзимологии и молекулярного механизма процесса реплнкации ДНК, основан на выделении и исследовании мутантов, характеризуюпзихся либо полной утратой, либо повреждением той или иной суще- 13. Генетический контроль синтеза ДНК -О О- к ! Π— Р=О ! Адеиоеии Рнс. 13.4.
ДНК-лигаза (Е) «зашнвает» одноцепочечный разрыв в цепи ДНК, используя энергию, поставляемую за счет гндролнза ннкотннамидаленннлннуклеотнда ()» МР-РМА). Реакция протекает через образование промежуточного комплекса фермент — АМР. Остаток АМР переносится на 5'-фосфатную группу в ме- сте разрыва. Образовавшийся дифос- фатный остаток гндролизуется за счет атаки ЗсОН-группы следующего нуклеотида с образованием ковалент- ной фосфодиэфирной связи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
