Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Обратите внимание на димерную структуру белка соА (один из моно- меров закрашен черным), Одна нз субъедиииц (или мономеров) белка образует ковалентную связь с 5'-фос- фатной группой разрыва на участке ог!. 88В-белки обозначены неокра- шенными кружками, Хозяйские функ- ции, необходимые для репликации )о чйго„включают хеликазу, топоизоме- разу, праймосому, ДНК-полимеразы 1 н 111, (По ЕоенЬегд Я. е! а1., 1977. Ргос. )ч(а!. Асад. Бс1. (38А 74, 319К) Экспрессия генетического материала белка, кодируемого фаговым цистроном А, а также от праймосомы, хеликазы, топоизомеразы и ДНК-полимеразгя 1 клетки-хозяина. Белок, продукт сй А, является эндонуклеазой, узнающей участок ол на ДНК фХ174 (расположенный внутри самого цистрона А) и вносяшей разрыв в (-ь )-цепь.
Таким образом, возникает 3'-ОН-за'гранка, на которой инициируется репликация ло механизму катящегося кольца, направляемого ДНК-лолимеразой 111. Одна из двух идентичных субъединиц димерного белка с!з А образует ковалентную связь с 5чРО -концом одноцепочечного разрыва. По окончании одного цикла репликации (рис.
13.! !) образуется двухцепочечная кольцевая ДНК, содержащая новообразованную ( + )-цепь, связанную с белком сь А, и отделяется дочерняя одноцепочечная фаговая ДНК. Ковалентное замыкание этой одноцепочечной ДНК в кольцо осуществляется самим белком ей А. Интересно отметить, что подобно тому, как у фага фХ!74 участок ол находится внутри гена А, так н у фага ь участок оН находится внутри последовательности гена О, кодируюшего белок, необходимый для репликации фаговой ДНК. Неизвестно, насколько универсален описанный механизм инициации реплнкации, основанный на действии ог(-специфичной эндонуклеазы. Участие в инициации репликации хромосомы Е.
сой топоизомеразы 11 (ДНК-гиразы) позволяет предположить возможность существования альтернативного механизма инициации, не связанного с участием особой эцпонуклеазы. ДНК-гираза направляет АТР-зависимый процесс расплетания двойной спирали, вводя отрицательные супервитки. Это может приводить к необходимому экспонированию матричных нитей без внесения одноцелочечного разрыва в точке начала репликации. Синтез ДНК у эукариот Подходы, разработанные при изучении процесса синтеза ДНК в прокариотических клетках, были применены и для анализа репликации эукариотических ДНК. Знание типов генетических функций, необходимых для репликации прокариотических ДНК, способствовало вьшвлению с ломошью биохимического анализа сходных функций и в эукариотнческих клетках. Геномы вирусов эукариот, такие, как двухцепочечная кольцевая ДНК вируса БЧ40„послужили удобной моделью для изучения эукариотических репликативных функций, подобно тому как небольшие фаговые геномы оказались весьма полезными для анализа процесса репликации у Е.
со!!. До настоящего времени генетический анализ процесса репликации у эукариот не играл столь существенной роли, как это было в случае прокариот. В эукариотических клетках были обнаружены три вида ДНК-полимеразной активности. Фермент Ро!а служит основной полимеразой, вовлеченной в синтез ДНК в репликатнвной вилке. Фермент Ро!р, судя по всему, участвует главным образом в репарационных процессах, а Ро!7-это единственная полимераза, обнаруженная в митохондриях, используемая, вероятно, для репликации митохондриального генома.
Для функционирования всех трех видов полимераз требуется наличие 3'-ОН-затравочного конца. Было показано также участие РНК-затравок в репликации эукариотических ДНК. В то же время были выявлены весьма существенные различия в том, как прокариотические и эукарио- 13. Генетический контроль синтеза ДИК тические ДНК-полимеразы осуществляют процесс исправления ошибок репликации (см. следующий раздел).
В эукариотических клетках были обнаружены и выделены в чистом виде ферменты, обладающие хеликазной и топоизомеразной активностями, а также белки, специфически связывающиеся с одноцепочечными участками ДНК. Несмотря на отсутствие исчерпывающей информации о протекании процессов синтеза ДНК, есть все основания полагать, что они в основных чертах являются общими как для прокариотических, так и для эукариотических клеток.
Точность синтеза ДНК Частота ошибочного включения нуклеотидов в новообразующуюся при репликации цепь ДНК, порождающая спонтанные мутации, крайне низка (1О ' — !О 'е). В то же время на основании физико-химического рассмотрения специфичности образования системы водородных связей между основаниями может быть предсказана значительно более высокая частота ошибочного включения — вплоть до ! 0 '. Таким образом, в обеспечении точности релликации ДНК помимо непосредственного образования водородных связей между комплементарными основаниями участвуют и дополнительные факторы контроля. Некоторые из этих дополнительных факторов, как оказалось, обусловлены функциональными особенностями самих полимераз.
Изучение ДНК-полимеразы ! Е. сой позволило выявить три фактора, вносящие вклад в обеспечение точности функционирования этого фермента. Считают, что при подходе и связывании очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата с трифосфатным центром (рис. 13.7) фермент осуществляет контроль общею размера новой нары оснований, возникающей при взаимодействии с основанием в матричной цепи, прежде чем запустить реакцию лолимеризации.
Только благодаря такому контролю частота возникновения ошибок снижается до 10 4-10 з. Связавшийся нуклеотид затем перемещается к центру связывания концевого участка затравки, где вновь происходит проверка правильности образования водородных связей между основаниями. Для образования ковалентной связи с 3'-ОН-группой концевого нуклеотида растущей цепи необходимо наличие правильной системы водородных связей, обеспечиваемой комплементарными взаимодействиями между основаниями. В случае ошибочного включения неправильного нуклеотида дальнейшая полимеризация блокируется н активируется присущая ферменту 3'— 5'-экзонуклеазная активность.
Происходит вырезание ошибочно включенного нуклеотш!а, фермент перемещается назад так, что в центр концевого участка затравки попадает предыдущий нуклеотид, после чего лолимеризация продолжается обычным путем. Таким образом, правильность каждого включающегося в растущую цепь нуклеотида проверяется дважды. 3' — 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы лри этом осуществляет корректорскую функцию (ргоо7гет(1лд), Если каждый этап проверки снижает частоту возникновения ошибок на два порядка (1О '), то при реализации двух независимых эталон проверки частота возникновения ошибок уже будет оцениваться величиной 10 Исследование точности репликации ДНК фага фХ174 ш ч11го ДНК-полимеразой 1, с использованием в качестве теста — определения инфекционной способности образующихся молекул ДНК, выявило возникно- 122 Экспрессия генетического материала вение ошибок с частотой около 10 е, очень близкой к величине, предсказанной на основании подобных расчетов (10 ' 1О ' 10 ').
Добавление к реакционной смеси очищенного ЯЗВ-белка понижало частоту возникновения ошибок еще в 10 раз. ДНК-полимераза П1 Е. сой также обладает 3'- 5'-экзонуклеазной активностью, придающей ферменту дополнительную корректорскую функцию. При использовании этого фермента для репликации ДНК фага фХ174 в системе ш И!го, подобно тому как это показано на рис. 13.11, частота возникновения ошибок оценивается величиной 5 10 ~. Существенно отметить, что даже такая низкая величина намного превышает реальное значение частоты возникновения ошибок прн синтезе ДНК Е. сой !и ч!чо (1О а-10 го).
Наблюдаемая повышенная точность процессов, протекающих 1п ч(чо, обусловлена существованием дополнительных репарационных функций, которые обсуждаются в следующем разделе. Эукариотические ДНК-полимеразы не обладают 3' -+ -~ 5'-экзонуклеазной активностью и обусловливают гораздо более высокую частоту возникновения ошибок при репликации ДНК фага фХ174 ш чйго. При одинаковых условиях для эукариотических полимераз наблюдались следуюпше частоты; 3 10 з для ДНК-полимеразы а(Ро1 сг), 1,2 — 3,0 10 л для ДНК-полимераз () и у. Очевидно, что для обеспечения необходимой точности репликации в эукариотических клетках должны присутствовать дополнительные ферменты, повышающие точность этого процесса.
Некоторые биохимические данные свидетельствуют о наличии у эукариот фермента с 3' -~ 5'-экзонуклеазной активностью, действующего в контакте с ДНК-полимеразой сс Этот фермент может обеспечивать корректорскую функцию ш ч)чо, утрачиваемую в ходе очистки ДНК-полимеразы а. Можно думать, что эволюция системы коррекции и других вариантов исправления ошибок репликации сделала возможным использование РНК в качестве затравки для обеспечения механизма синтеза отстающей цепи ДНК.
Способность РНК-полимеразы синтезировать цепь с(е почо без какой бы то ни было затравки, вероятно, сопряжена с более высокой частотой возникновения ошибок, чем в случае ДНК-полнмераз, способных функционировать только при наличии затравки. Удаление потенциально ошибочной РНК-затравки 5' -~ 3'-экзонуклеазами и ее замещение на ДНК, являющуюся объектом тщательного контроля и коррекции, устраняют проблему возникновения ошибок, связанную с инициацией синтеза йе почи. Исправление ошибок репликации и репарация ДНК Несмотря на корректорские функции, присущие ДНК-полимеразам Е. сой, некоторые нуклеотиды оказываются все же ошибочно включенными в новообразованную цель ДНК.
Их присутствие делает возможным возникновение спонтанных мутаций, в том случае если ошибки не будут исправлены до начала следующего цикла репликации. Свидетельства в пользу существования пострепликационных систем исправления ошибок, илн репарации, были получены при изучении таких явлений, как !3. Генетический контроль синтеза ДНК !гз генная конверсия и высокая отрицательная интерференция, связанных с рекомбинационными процессами (см. гл. 14). Дополнительные данные были получены благодаря обнаружению мутаций, инактивнрующнх ферменты, вовлеченные в систему исправления ошибок реплнкацни.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
