Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 26
Текст из файла (страница 26)
В то же время эту функцию Ро)1 нельзя назвать жизненно важной, поскольку в ро!А- мутантном штамме с ней вполне успешно справляется фермент Ро! П1. Изучение штаммов, мутантных по гену ро! П (например, мутация ро)В полностью выводит из строя этот фермент), показало, что активность этой ДНК-полимеразы не является жизненно важной; ее непосредственная функциональная роль в клетке не установлена. С другой стороны, генетический анализ продемонстрировал, что присутствие Ро! П1 необходимо для синтеза ДНК в репликативной вилке. ДНК-полимераза 1П-это полисубъединичный фермент, субъединицы которого кодируются жизненно важными генами с)паЕ, НиаХ и Ипат, а также некоторыми другими, еще не идентифицированными генами. Этот фермент необходим для синтеза как ведущей, так н отстающей цепей ДНК. При синтезе отстающей цепи Ро! П1 использует РНК-затравки, синтезируемые праймазой, которую кодирует жизненно важный ген г)па 6.
возможных перекрывающихся фрагментов, начинающихся с праймерного участка и статистически обрывающихся на 3'-концевом остатке А. Данный способ определения последовательности ДНК наиболее эффективно применяется для рестрикционных фрагментов ДНК, встроенных в двухцепочечную реплнкатнвную форму клонирующего вектора, сконструированного на основе одноцепочечной ДНК фага М!3. Выделение фаговых частиц, образующихся после трансфекции полученным таким образом двухцепочечным рекомбинантным фаговым геномом, служит непосредственным источником кольцевых одноцепочечных ДНК-матриц, которые используют для определения нуклеотидной последовательности.
Описанный метод схематически изображен на рнс. !3.9. ДНК-полимеразу 1, используемую для Экспрессия генетического материала определения последовательности ДНК методом терминации цепи, определенным образом обрабатывают для того, чтобы избавиться от свойственной этому ферменту 5' — 3' экзонуклеазной активности. Активность этого типа может мешать осуществлению манипуляций, приведенных на рис. 13.9, атакуя 5'-конец праймера, используемого для инициации полимеризации.
При обработке ДНК-полимеразы 1 протеиназой субтилизином, происходит расщепление фермента на два крупных полипептида, один из которых проявляет 5' — 3'экзонуклеазную активность, а другой содержит каталитический центр полимеризацни. Последний фрагмент (известнзяй как фрагмент Кленова) сохраняет полимеразную активность и может быть полностью очищен от примеси 5' -+ -+ 3'-экзонуклеазного фрагмента. 13. Генетический контроль синтеза ДНК 117 Биохимический анализ механизма репликации ДНК основан на выделении и очистке ферментов и других белков, осуществляющих одну или несколько стадий репликацнонного процесса ш ч!1го. Разработке и изучению системы репликации зп ч!1го в значительной мере способствовало использование в качестве матриц небольших подробно охарактеризованных вирусных геномов„например фага фХ!74, поскольку продукты их репликации зп ч!гго также легко поддаются изучению.
Образование способных к инфекции молекул вирусной ДНК ш чйго может лежать в основе однозначного биологического теста на аутентичность продукта репликации. Системы репликации ш чйто были разработаны для одноцепочечных кольцевых ДНК фагов фХ!74, О4 и М13. Благодаря этим исследованиям удалось сделать весьма примечательное наблюдение, что эти фаги, каждый из которых может инфицировать Е. сод, используют для своей репликации различные наборы генетических функций Е. сой, связанных с синтезом хозяйской ДНК. На ДНК М13, окруженной БЯВ-белками, инициация синтеза комплементарной цепи ДНК зависит от синтеза РНК-затравки в определенном участке кольца, направляемого РНК-полимеразой хозяина, которая в норме отвечает за транскрипцию хозяйской ДНК.
РНК-полнмеразу ингибирует антибиотик рифампицин, который подавляет также репликацию ДНК фага М13 ш чйго и ш ч!чо. С другой стороны, ДНК фага О4, также связанная с %В-белком, для синтеза инициирующей РНК-затравки использует другой фермент клетки-хозяина — праймазу (продукт гена аиа 6). В то же время для синтеза РНК-затравки и инициации репликации ДНК фага фХ!74, связанной с ББВ-белком, требуется участие целого ряда хозяйских белков, включая и продукты генов ь)иаВ и с(иаС.
Во всех трех случаях синтез ДНК на образовавшейся РНК-затравке инициируется ДНК- полимеразой П1. По-видимому, в репликации фХ174 участвуют все ферменты хозяина, связанные с синтезом отстающей цепи ДНК в репликативной вилке, а в случае фатов О4 и М!3 необходимым является участие тех ферментов, которые используются только для инициации репликации хромосомы. Совокупносп, процессов, связанных с синтезом ДНК в репликативной вилке, схематически представлена на рис.
!3.10. Для образования вилки фермент хеликаза разделяет цепи родительской ДНК. В этом процессе участвует также топоизомераза, релаксирующая возникающие при расплетании дополнительные витки. С открывшимися одноцепочечными участками ДНК связываются молекулы ЯЗВ-белка. Синтез ведущей цепи направляется ДНК-полимеразой П1. Синтез затравочных фрагментов (праймеров), необходимых для образования отстающей цепи, осуществляется сложным ферментативным комплексом, который называют ираймосозьой, функционирующим в тесном контакте с хеликазой.
В состав праймосомы входят продукты генов аиаВ, ь(иаС и аиаб, а также еще четыре белка — продукты неидентнфицированных ~снов и, и', и" н й Вероятно, ббльшая часть этих белков нснользуется для удаления молекул БЯВ-белка и экспонирования участка, на котором праймаза (с)па О) может инициировать синтез затравки. По мере расплетания родительской двойной спирали праймосома вместе с хеликазой активно продвигаются по цепи. Для осуществления этого процесса требуется затрата энергии, поставляемой за счет гидролиза АТР белком и'.
РНК- затравки необходимы для инициации синтеза ДНК ферментом Ро! П1. Удаление затравок реализуется за счет 5' — 3'-экзонуклеазпой активно- 118 Экспрессия генетического материала 5' 3' Рис. 13.10. Предпола- гаемая роль белков праймосомы (цветные) н других белков, уча- ствующих в реплика- ции ДИК в реплика- тивной вилке у Е. со!Ь (По Ага1 К.1., !ов Я.1, Когнбегд А., 1981. Ргос, Хаг. Асад.
Вой (ЛА 78, 707.) лад 5 3 Отстающая цель иеиь сти ДНК-полимеразы 1, которая благодаря своей полимеразной активности может также участвовать в заполнении брешей, возникших после удаления затравочных фрагментов. Остающиеся после этого 3'-ОН/5'-РО -одноцепочечные разрывы зашиваются ДНК-лигазой, которая, таким образом, завершает образование непрерывного сахарофосфатного ос~она отстающей цепи. Инициация синтеза ДНК в точке начала репликации Релликация ДНК инициируется на участках с определенной нуклеотндной последовательностью, обозначаемых ом (от англ. ог(д(н — начало).
В большинстве прокариотических геномов содержится по одному участку оН, а в значительно превышающих их ло размеру эукариотических хромосомах имеется, как правило, целый ряд таких участков (см. рис. 4.24). При инициации репликации ДНК обычно возникают две репликативные вилки, продвигающиеся в противоположных направлениях от точки инициации. Биохимические детали механизма инициации репликацни хромосомы Е. сой изучены достаточно слабо.
С помощью генетического анализа удалось обнаружить, что для инициации репликации необходимо участие продуктов генов длаА, г(ла1 и диаР, а также генов дугА и дугВ, кодирующих субъединицы топоизомеразы П. Кроме того,лри инициации или сразу после нее требуется наличие ДНК-полимеразы 1П и продуктов генов днаВ н днаС, вероятно, для того, чтобы начать полимернзацию в новообразовавшейся репликативной вилке. Инициация синтеза ДНК ингибируется рифампицином, что указывает на возможное участие РНК-полимеразы, отличной от собственно праймазы. Однако какова именно роль РНК-полнмеразы в этом процессе— неизвестно.
Недавно с помощью методов генной инженерии были сконструиро- 119 да А ЮСЭ (+) НачалО Начала ! АТР ! омтР ! 1 ! Ферменты лааямна Ла авв о ! (+) (+) наны небольшие плазмиды, репликация которых зависит от встроенного в них участка оп' из хромосомы Е. сой. Используя зти плазмиды, можно будет создать систему инициации репликации ш чйго, включающую продукты генов длаА, дна1 и е(нар, с помощью которой, вероятно, удастся изучить детали механизма инициации. До сих пор наиболее подробно процесс инициации репликации был изучен на двухцепочечной ДНК фага фХ174. Образование такой формы из одноцепочечной геномной ДНК происходит вскоре после инфекции и зависит только от клетки-хозяина, в частности от рассмотренного выше функционирования праймосомы.
Однако последующая репликация двухцепочечной кольцевой ДНК и образование одноцепочечных колец, входяппзх в состав дочерних фаговых частиц, зависит уже от действия 13. Генетический контроль синтеза ДНК Рис. 13.11. Участие белка снА фага фХ174 в инициации н термннации синтеза ( + )-цепи одноцепочечного фагового генома и репликацнн РФ- фаговой ДНК (о тдгго. Символом РФ1 обозначена ковалентно замкну- тая (суперспирализованная) кольцевая двуцхепочечная ДНК. РФП-это про- межуточная двухцепочечная структу- ра, содержащая разрыв в одной це- пи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
