Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Было установлено, что функциональиьш участок РОР' содержит по 240 п.н. с каждой стороны от кора. В то же время функционально необходимый участок ВОВ' по размеру не намного превышает саму 15-нуклеотидную кор-последовательность. Участки нуклеотидной последовательности, с которыми специфически связывается интеграза фага Х, были идентифицированы с помощью так называемого «футпринтинга» (от англ. уоосрг(пс — след ноги: см. Дополнение 14.2). В связывании участвуют центральная область РОР' протяженностью 34 п.и., включающая кор, а также два участка последовательности в плече Р и один, более протяженный, в плече Р'.
С другой стороны, единственный участок узнавания на хромосоме представляет собой последовательность из 20 п.н., включающую область кора ВОВ'. Вследствие различий в структуре плечевых участков фагово. го и хозяйского ап-сайтов рекомбинантные сайты РОВ' и ВОР' в функциональном отношении отличаются от РОР' и ВОВ'. Это отличие несомненно и проявляется в том, что интеграза, направляющая процесс встраивания профага, сама по себе оказывается неспособной катализировать обратную реакцию, для осуществления которой необходимо участие дополнительного белка-продукта гена хЬ.
Механизмы встраивания и вырезания профага пока в точности н» известны. Установлено, что очищенная интеграза обладает топоизомеразной активностью. Она делает одноцепочечный разрыв в суперскру. ченной ДНК, благодаря чему осуществляются свободное вращение и удаление супервитков. Вслед за этим интеграза направляет замыканис фосфодиэфирной связи без использования каких-либо дополнительныэ источников энергии. Считают, что энергия первоначально расщепленной связи сохраняется благодаря ковалентному связыванию высвободив.
шейся 5'-фосфатной группы с самой иитегразой. Известно, что при ре. комбинации между РОР' и ВОВ' образуется очень короткий участок ге РОР' ТТСАССТТТТТТАТАСТААСТТС А А С Т С С А А А А А А Т А Т 6 А Т Т С А А С В' С С С Т С С Т Т Т Т Т Т А Т А С Т А А С Т Т С С С С А С С А А А А А А Т А Т С А Т Т С А А С Рис. 14.!4. Нукнеотидные последовательности внутри и вокруг общего 15-нуклеотндного кора (выделены жирным шрифтом) участков РОР' и ВОВ', а также рекомбинантных участков ВОР' и РОВ'. Отмечены гетеродуплексные области ДНК на участках ВОР' и РОВ; обра- зующнеск в резувьтате !пг-зависимой рекомбинации.
(По М!гнисй! К. е! а1., 1981. СоЫ Бргщй НагЬог Бушр. Оцапг. В!оЬ 45, 4Ж-437.) ВОР СССТССТТТТТТАТАСТААСТТС С С С А С С А А А А А А Т А Т С А Т Т С А А С Т Т С А 6 С Т Т Т Т Т Т А Т А С Т А А С Т Т С РОв' А А С Т С С А А А А А А Т А Т С А Т Т С А А С 15б теродуплексной ДНК, а два одноцепочечных разрыва возникают в разных точках внутри общей кор-последовательности.
Как показано на рис. 14.14, расстояние между точками разрыва составляет 7 п.н. На основании данных электронной микроскопии можно предположить, что мономерные молекулы интегразы при взаимодействии с ДНК олигомеризуются, что способствует образованию контактов между участками РОР' и ВОВ'. Разрезание и воссоединение цепей, приводящее к рекомбинации, может протекать с образованием промежуточной формы, подобной структуре Холлидея с очень коротким гетеродуплексным участком.
При 1пг-зависимой рекомбинации в редких случаях удается наблюдать образование гетеродуплексных участков, заметно выходящих за пределы области РОР'. Таким образом, возникновение промежуточной крестообразной структуры характерно как для сайт-специфической, так н для обшей рекомбинации. Как уже упоминалось, для осуществления сайт-специфической рекомбинации фага Х необходимо присутствие некоторых хозяйских белков.
Штаммы Е. сой, мутантные по одному из генов й1тА, й1тВ или Ыр, неспособны обеспечивать интеграцию профага 1с. Мутации в этих генах носят плейотропный характер и блокируют также интеграцию других типов профагов на других соответствующих участках ДНК. Более того, эти мутации препятствуют развитию в клетках транспозоноподобного фага Мц, а также точному вырезанию транспозонов, определяющих устойчивость к антибиотикам (см. следующий раздел).
Плейотропность этих мутаций, сказывающихся как на сайт-специфической, так и на незаконной рекомбинации, свидетельствует о том, что соответствующие клеточные белки играют скорее некоторую неспецифическую роль, например способствуют реализации взаимодействий ДНК-ДНК илн ДНК вЂ” белок. Взаимодействие белков с определенными нуклеотндными последовательностями ДНК играет важнейшую роль в функционировании генетического материала. Для изучения взаимодействий между белками и участками пуклеотидной последовательности удается использовать те же экспериментальные подходы, что и для определения нуклеотидной последовательности. В гл.
9 мы рассмотрели, как при электрофоретическом анализе одной из цепей рестрнкционного фрагмента ДНК„содержащей радиоактивную метку на одном конце и случайно расщепленной тем Экспрессия генетического материала или иным способом, удается выявить полный набор фрагментов, отличающихся последовательным изменением длины с шагом в один нуклеотнд. В примере, приведенном на рис.
9.8, случайное расщепление в каждом случае происходит по одному из четырех иуклеотидов. Все возможные фрагменты таким образом распределяются по четырем дорожкам, в каждой из которых разделяются фрагменты, заканчивающиеся на А, Т, О нли С. Прн этом нуклеотидную последовательность искомого фрагмента ДНК можно считывать непосредственно по радиоавтографу, полученному с геля после электрофореза. ! 4. Раком би лая ия !57 Иягсграза А+С Гспарии с+т +тсо Р'-плечо ° е нор-последо- вательность Функциональная область аир Р-плече Р -алсчо1 Рис. 14.! 5.
Локализа- ция сайтов связывания интегразы фага Х с участком РОР' с по- мощью метода «фут- приигиигаж Аликвоты, содержащие рестрик- циониый фрагмент, 5чконец одной из це- пей которого помечен "Р, подвергали ча- стичному расщеплению неокарциностатином (расщепляет по А и Т) в присутствии и в от- сутствие интегразы или гепарина. Набор образующихся фраг- Мьнтов анализировали с помощью гель-злек- трофореза (три левые дорожки), В двух правых дорожках— фрагменты, образую- щиеся при расщепле- нии того же меченого фрагмента по пури- новым или по пирими- диновым нуклеотидам методом Максама.- 1 илберта, для иденти- фикации участков по- следовательности, защищаемых интес ра- зой.
(По Наа Р.1, Дои И'., 1ал4у А., !980. )Ча!цге, 285, 85-91.) йергю!еб Ьу реппйяоп. Соруг!8Ы (© 1980- Масглй)ап)онгпаЫаип!!ед. В том случае, когда нуклеотидная последовательность уже известна, можно установить, какие участки последовательности связываются с определенным белком. Для это!о достаточно определить участки, защищаемые этим белком от расщепления. Защищенные участки идентифицируются на основании данных электрофореза, по исчезновению полос, соответствующих продуктам статистического расщепления, концевые нуклеотиды которых попадают в область связывания с белком. Именно этот подход был использован для локализации сайтов связы- вания интегразы с участком РОР' ДНК фага )с. Рестрикционный фра! мент, содержащий участок РОР' и меченый ззр по одному из 5цконцов, случайно расщепляли ДНКазой 1(или любым другим способом.
приводящим к образованию одноцепочечных разрывов) в присутствии и в отсутствие интегразы. После этого оба образца нагревали для расхождения цепей, только одна из которых содержала метку, и анализировали с помощью электрофореза. Результаты такого эксперимента представлены на рис. !4.!5. При электрофорезе 158 Подвижные генетические элементы В гл. 8 мы рассмотрели основные особенности внедряющихся последовательностей (или 18-элементов) и транспозонов. Подвижные элементы представляют собой автономные единицы, в нуклеотидной последовательности которых заключена информация о структуре специализированных белков, обеспечивающих их перемещение.
Такое перемещение (или транспозиция) достигается за счет специфического взаимодействия соответствующего белка с концевыми последовательностями перемещающегося элемента. Процесс транспозиции можно разделить на два этапа. На первом — нуклеотидная последовательность концевых участков подвижного элемента соединяется с ДНК-мишенью, специфически расщепленной на участке встраивания. На втором этапе происходит репликация подвижного элемента, не сопровождающаяся реплнкацией ДНК, в которую происходит встраивание.
Таким образом, одна копия подвижного элемента оказывается включенной в ДНК-мишень, а другая сохраняет свою прежнюю локализацию. При этом обычно происходит дупликация небольших участков последовательности ДНК-мишени (по 5 — 9 п.н.), примыкающих к каждому из концов встроившегося элемента. Для подвижных элементов различного типа порядок реализации этих этапов может быть различным. Был предложен целый ряд возможных механизмов транспознции. Следует отметить, что в рамках такого механизма удовлетворительное объяснение должны найти самые разнообразные явления, так или иначе связанные с транспозицией (рис. 14.! б). На сегодняшний день наиболее полно изучены подвижные элементы ТпЗ и родственный ему 78. Транспозон ТпЗ имеет размер 4957 п.и.
и содержит ген, кодирующий фермент (3-лактамазу (В!а, рис. !4.17), определяющий устойчивость к ампициллину. На обоих концах ТпЗ находятся инвертированные повторы протяженностью 38 п.н. При анализе мутантов ТпЗ было установлено, что для проявления транспозиционной активности последовательности обоих повторов должны оставаться неповрежденными. Мутационные изменения в этих последовательностях не образца, расщепленного в отсутствие интегразы, наблюдается полный набор фрагментов расщепления, В случае образца, полученного в присутствии интегразы, выявляются характерные пропуски (или иследыя —.3оогрг(пге), соответствующие участкам последовательности, защищенным от расщепления, благодаря связыванию с интегразой.
Сравнивая положения пропусков с расположением ! фрагментов, образующихся при использовании специфических методов расщепления (также показано на рис. 14.15), удается точно идентифицировать защищенные нуклеотиды в известной последовательности области РОР'. Как показано на рисун- Экспрессия генетического материига ке, интеграза защищает общую кор-последовательность (рис. 14.14), а также один участок в плече Р' и два участка в плече Р.
В эксперименте, отраженном на рис. 14.15, для изучения относительной прочности связывания интегразы с различными участками РОР' используется конкурентное связывание с ДНК полианиона гепарнна. Можно видеть, что гепарин вытесняет интегразу из всех участков связывания, за исключением сайта, расположенного в плече Р'. Вероятно, с этим сайтом интеграза связывается значительно прочнее, чем с другими сайтами узнавания белка в области РОР'.
14. Рекомбиттат1ия Межыолекулярные процессы: транспознцня Кошпетрацня— слнянне реплнконов Внутрпыолекулярные процессы: точное вырезанне ХУ ЯВСРŠ— ь Двойная инверсия ХУ ЯВСРЕ делетпрованне ХУ ЯВСРŠ— ь Встраивание ло сосепству Смешанные процессы: $:) Кооперапшная транспознвпя удается скомпенсировать с помощью комплементации, что свидетельствует о непосредственном участии концевых повторов в механизме транспозиции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
