Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Точечные замены в положениях — 57 и — 66 в области САРюайта проявляются в фенотнпе 1ас, верояпю препятствуя кооперативному связыванию пары дн- меров САР-белка с соответствующей симметричной последовательностью )подчеркнута с обеих сторон). (По Яегн!йод'И'.$., АЬе)тон !.Аа 1978, 1л ТЬе Орегон. ед, Ьу 1.Н, Мй!ег, Тйв. Б. Кецзйгой; СоИ Брппй НагЬог ЕаЬогазогу, Со!д Брг!пй НагЬог Ть).Т2. и О*р)ей! М,С. ег а1., !981. Ргос. Ыар. Асад. Яс!. !)БА 78, 2213.) 15. Регуляция экспрессии гекое у прокариот 5'ТООААТТОТОАОССОАТААСААТТ 3' 3'АССТТАЯСАСТСОССТАТТОТТАА 5' Рис, 15.10. Нуклеотилпая последовательность ДНК, свяэывающаяся с )ас-репрессором.
Оттенены палинлромаые последовательности, расположенные симметрично вокруг оси вращения )цветная точка). С этими симметричными последовательностями связываются две субъедииицы тетрамериого репрессора. ций 1, обозначаемых 1 о. Конститутивные мутации 1 о подавляют способность репрессора связываться с операторной ДНК. В частичных диплоидах они ведут себя как доминантные — генотипу 1 ~/1' соответствует конститутивный фенотип.
Доминантность этих мутаций реализуется за счет образования смешанных тетрамеров. Смешанная пара, состоящая из мутантной и нормальной субъединицы, утрачивает способность к кооперативному связыванию с ДНК и соответственно к подавлению транскрипции. Все мутации 1+ картируются на участке гена 1, кодирующем )ч)-концевую область полипептида, т.е, ту область, которая непосредственно связывается с ДНК.
С другой стороны, репрессор, продуцируемый мутантными кле~ками 1 , способен нормально связываться с нндуктором. Это означает, что участок связывания с индуктором локализуется вне Н-концевой области репрессора. Такое представление подтверждается при рассмотрении мутаций 1 другого типа 1, которые проявляются в фенотипе суперрепрессии. В клетках 1х репрессор связывается с оператором независимо от присутствия индуктора. Все мутации этого типа картируются в гене 1 вне области, кодирующей 50 Х-концевых аминокислотных остатков репрессора.
Таким образом, можно полагать, что )ас-релрессор содержит два функционально различных домена. Представления о доменной организации молекульг репрессора были подтверждены с помощью биохимических методов. При обработке очищенного нативного репрессора протеолитическим ферментом трипсином )ч-концевые полипептиды отщепляются от тетрамерного «кора». Оставшийся после этого кор-белок может связывать индуктор, но не способен связываться с ДНК. Таким образом, )ч)-концевые участки полипептидных цепей (протяженностью около 50 аминокислотных остатков), вероятно, выступают за пределы относительно компактного тетра- мерного кора и могут «внедряться» в бороздки двойной спирали ДНК, узнавать и прочно связываться с операторной последовательностью.
Как мы убедимся в дальнейшем, такой способ структурно-функциональной организации характерен для многих белков, специфически узнающих определенные последовательности ДНК. Взаимодействие очищенного )ас-репрессора с ДНК подробно изучено ш ч31го. Для оценки прочности связывания белка как с операторной, так и с любой другой ДНК можно пользоваться значением кон- Экспрессии генетического материала станты диссоциации, определяемой по закону действующих масс как )" О] !К] К= — —, [ОК] Скопьже Репрессор-~ Диффузия через пязозопь Рис. 1 5.1 1. Схематическое изображение процесса поиска 1ас-репрессором области 1асоператора на хромосоме Е. сой, организованной в тесно сплетенный клубок -иуклеоид.
Подробности — в тексте. яос жл1' епезия где ! О], !К], !ОК] — это малярные концентрации операторной ДНК, репрессора и комплекса оператор — репрессор соответственно. Для оператор-репрессорного комплекса значение К составляет величину порядка 10 'з М, что свидетельствует о высокой прочности этого комплекса.
Исходя из этих данных становится ясно, почему присутствие всего лишь десяти молекул репрессора в хлетке оказывается достаточным для полной репрессии 1ас-оперона. Репрессор обладает также достаточно высоким сродством и к неоператорной ДНК. Так, с ро!у-с)!АТ) он связывается с константой диссоциации около 10 ' М. На прочности связывания с неоператорной ДНК присутствие индуктора никак не сказывается.
Эти данные указывают на то, что в клетке новосинтезированные молекулы репрессора, а также комплексы репрессор-индуктор всегда связаны с ДНК. Тетрамеры репрсссора, судя по всему, отыскивают операторную последователыюсть скорее с помощью линейной диффузии, или «скольжения», по хромосоме, чем посредством обычной пространственной диффузии в цитозоле.
Ясно, что первый способ поиска должен бьыь намного оперативнее второго (рис. 15.!1). Именно потребности быстрого поиска, по-видимому, объясняют особую выгоду палиндромного строения операторной последовательности, которая в этом случае может быть идентифицирована репрессором при продвижении по хромосоме с любой стороны.
Модель поиска оператора 1ас-репрессором, основанная на представлении !5. Регуляция экеяреееии генов у нрокариот о скольжении по хромосоме, помогает понять также выгоду тетрамерной структуры, которая характерна для репрессора, несмотря на то, что собственно с ДНК связываются только две из четырех субъединиц белка.
Как известно, хромосома Е.со!1, имеющая колоссальный линейный размер, в действительности плотно сплетена в очень хомпактный клубок — нуклеоид. Кроме того, с ДНК связано множество различных белков, которые также могут препятствовать свободному скольжению !асрепрессора. Наличие у связанного с ДНК репрессора илишней» пары свободных субъединиц может способствовать его перемещению от одного сегмента ДНК к другому и тахим образом облегчать доступ к искомой операторной области (рис.
!5.11). Катаболитная репрессия Е.ае-репрессор служит типичным примером белка — негативного регулятора, при действии которого подавляется экспрессия контролируемых им генов. Действие репрессора в свою очередь контролируется низко- молекулярными эффекторами — в данном случае аллолактозой. В действительности 1ае-оперон находится также под контролем белка — позитивного регуля~ора, вовлеченно~о одновременно в ре~уляцию цело~о ряда различных катаболитных систем Е.ео!с Действие этого позитивного регулятора опосредованно контролируется оптимальным источником углерода — глюкозой. Глюкоза ингибирует транскрипцию генов 1асоперона даже в присутствии лактозы, причем в штаммах с и О' в той же степени, что и в диких штаммах.
Это означает, что действие глюкозы не влияет непосредственно на взаимодействие репрессора и оператора. Действие глюкозы реализуется через посредника, в роли которого выступает циклический АМР (сАМР). Содержание сАМР внутри клетки контролируется с помощью двух уравновешивающих друг друга процессов-синтеза при участии аденилатциклазы и деградации под действием фосфодиэстеразы (рис. 15.12).
В отсутствие глюкозы наблюдается высокий, а в ее присутствии — низкий уровень сАМР в клетке. Механизм, благодаря которому содержание глюкозы в клетке контролирует уровень сАМР, неизвестен. Тем не менее не вызывает сомнений, что сАМР служит в качестве эффектора, отражающего этот аспект клеточного метаболизма. Изучение мутантов, неспособных к активации катаболитных функций, позволило выявить механизм влияния сАМР на транскрипцию генов !ас-оперона.
Обнаружены два типа такого рода мутаций. Мутации первого типа приводят к инактивации аденилатпиклазы (рис. !5.12). Мутации второго типа инактивируют белок — активатор катаболитных генов (или САР-белок от англ. еасаЬо!ссе асссоасог ргосет), связывающий сАМР. Мутанты этого типа можно отобрать благодаря тому, что они неспособны утилизировать одновременно два различных типа сахаров (в частности, лахтозу и глюкозу) в качестве источников углерода. Оказалось, что мутации, подавляющие обе функции одновременно, картируются в генах, отличных от тех, которые входят а состав какого-либо из соответствующих оперонов, но необходимых для экспрессии обоих оперонов и утилизации как лактозы, так и галактозы.
182 ® — О— З-АМР ОН ОН Изучение транскрипции генов 1ас тп ч11го с использованием 1ас-оперона, встроенного в ДНК трансдуцируюшего фага )э очищенной РНК- полимераэы и очищенного САР-белка, показало, что САР-белок стимулирует транскрипцию только в виде комплекса с сАМР. Участок связывания комплекса САР— сАМР примыкает к промотору !ас, о чем свидетельствует отсутствие влияния сАМР на транскрипцию мутантного )ас-оперона, содержащего делецию 1.1 иа участке от гена 1 до промотора, которая в то же время не сказывается на связывании с промотором РНК-полимеразы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
