Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Насколько сложными должны быть механизмы генетической регуляции, контролирующие эти процессы;вопрос спорный. Определенную ясность в этот вопрос могут внести некоторые количественные выклад- !6. Регуляция экспрессии генов у эукариот 207 ки. Число белков, кодируемых ДНК какого-либо организма, может служить разумной оценкой числа генетических функций, необходимых для его развития и воспроизводства. Такой параметр, как слоисность последовательности ДНК (Х) данного организма, задает верхний предел числу кодируемых белков (см. гл. 9). В то же время известно, что лишь небольшая часть последовательности в эукариотических ДНК действительно кодирует те или иные белки.
Многие участки ДНК транскрибируются в форме гяРНК, которые впоследствии не транспортируются в цитоплазму и не образуют мРНК, подлежаших трансляции. В ходе созревания некоторых гяРНК в мРНК происходит удаление избыточных 3'-концевых последовательностей и иитронов (см. гл. 11). Только около 10;~; транскрибируемых последовательностей действительно превращаются в последовательности мРНК.
Допустив, что в ходе развития организма в клетках различно~о типа в совокупности происходит транскрипция всех последовательностей, присутствующих в эукариотическом 1еноме в виде одной копии, можно оценить максимальное число белков, продуцируемых данным организмом. Геном человека состоит примерно из 2,9 10э п.н., 70",', которых входит в состав однокопийиых последовательностей ДНК. Это означает, что сложность популяции мРНК может достигать 2 10' нуклеотидов. Поскольку белок среднего размера кодируется мРНК длиной около 1800 нуклеотидов, максимальное число белков человеческого организма оценивается величиной 110000. Сходные расчеты позволяют получить оценку максимального числа белков: ! 7000 — для морского ежа и 7250 — для (Угоэорй!!а те!аподажег.
Последняя величина достаточно хорошо согласуется с числом комплементационных групп, выявленных при исследовании различных мутантов, а также с числом дисков в цолитенных хромосомах (5 000 — б 000). Изучение механизмов регуляции генов у эукариот является одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной генетики. Наши сегодняшние представления о молекулярных механизмах экспрессии генов у эукариотических организмов в значительной мере основаны на результатах, полученных с применением методов рекомбинантных ДНК.
Поскольку эти новые методы стали доступны лишь сравнительно недавно, имеющиеся сегодня сведения о структуре и регуляции эукариотических генов весьма фрагментарны. Как обсуждалось в гл. !5, регуляция прокариотических генов осуществляется за счет взаимодействия специализированных регуляторных белков с регуляторными участками последовательности ДНК.
Теперь мы знаем, что это в равной мере относится и к регуляции эукариотических генов. Применение методов работы с рекомбинантными ДНК позволило выделить и изучить целый ряд индивидуальных генов и тесно сцепленных с ними регуляторных последовательностей из различных типов эукариотических клеток и их вирусов. В результате таких исследований удалось значительно расширить круг представлений о структуре кодирующих и некодирующих участков эукариотических ДНК и РНК-транскриптов. Контроль образования мРНК может осуществляться внутри ядра на нескольких различных уровнях. Как уже отмечалось, многие эукариотические гены состоят из экзонов и интронов, причем созревание мРНК сопровождается вырезанием интронов из соответствующих первичных РНК-транскриптов, то есть сплайсингом. Контроль экспрессии генов 208 Экспрессия генетического материала Таблица 16.1.
Возможные уровни регуляции экспрессии генов Уровни регуляции Количество примеров Ядерный Транскрипция Инициация Терминация (аттенуация) Процессинг ядерной РНК Полналенилироваиие Сллайсинг Цитоплалматический Стабильность мРНК Множество, > 100 1 3 2 5 на уровне определенных генов; множество на общем уровне.
10 на уровне определенных генов; множество на общем уровне. Эффективность трансляции мРНК Составлено по Патей ЛЕ., 1т. 1982. батте, 297, Зб5, Участки ДНК, контролирующие транскрипцию По аналогии с прокариотами можно ожидать, что в инициации транскрипции эукариотическик генов должны участвовать промоторные последовательности, расположенные в ДНК недалеко от точки инициации синтеза РНК (с 5цконца данного гена).
С использованием методов, описанных в гл. 9, удалось клонировать значительное количество структурных генов из различных эукариотических клеток н их вирусов. Сравнение 5сфланкирующих последовательностей этих генов позволило выявить очень характерную А-Т-богатую последовательность, распо- может осуществляться как на уровне самой транскрипции, так и на уровне сплайсинга. Более того, ДНК в эукариотических клетках организована в нуклеосомы, которые в свою очередь формируют хроматиновые структуры более высокого порядка (см.
гл. 4). В зависимости от локальной структуры хроматина данные участки ДНК могут находиться в состоянии, доступном или недоступном для действия РНК-полимеразы, то есть структура хроматина также может влиять на регуляцию транскрипции. В табл. !6.1 приведены возможные уровни регуляции эукариотнческих генов и сведения о количестве примероц на которых удалось показать реализацию того или иного уровня регуляции.
Кроме того, так как у эукариот транскрипция не сопряжена непосредственно с трансляцией, то возможен и фактически реализуется цитоплазматический контроль использования регуляторных мРНК. Все эти контролирующие и регуляторные механизмы, без сомнения, требуют участия специализированных белков (и, возможно, некоторых молекул РНК), действующих на соответствующие регуляторные участки ДНК или РНК. В настоящее время сведения о природе этих регуляторных молекул весьма ограничены. Оливка есть основания полагать, что в ближайшие годы наши представления в этой области могут существенно расшириться.
16. Регуляция экспрессии генов у эукариот 209 от -33 яо -27 от-27 ао-21 Сп Сзь Сп Тзз Ам Тзз Лзз Азз Азз Тзь Лн Со Ть Тзз Сь Сз Тз Л» Тз Тзь Ть Азь Сн Сзь Яь С, Аз Сз Сз Се Аз Тз Сз Тз Сз Т Л Т А Т А А А Т 3 Т А 1 2 3 4 3 б 7 Обобзненнм ооелеаоватеньноеть Рис. 16.1. Сравнение 5'-фланкирую- щих последовательностей для 4! эукариотнческого гена, Цифровые ин- дексы соответствуют числу случаев в которых данный нуклеотнд зани- мает данное положение в некоди- рующей цепи ДНК (то есть в той, которая комплементарна цепи, слу- жащей матрицей для синтеза РНК).
Соотнесение последовательностей осуществлено по принципу получения максимального сходства, поэтому, как отмечено в верхней строке, наблюдаются определенные различия в расстояниях мехсду данным нуклеотидом и точкой начала транскрипции (первый транскрибируемый пуклеотип имеет номер + 1). Внизу приведена обобщенная (сонвепвнв) нли так называемая ТАТА-последовательность. (По Соте)вн 1.
ег а1., !980. Всзенсе 209, 1406.) лагаюшуюся, как правило, за 20 — 30 нуклеотидов до точки начала транскрипции. Этот участок, названный Гольдберг-Хогнесс-боксом (по аналогии с Прибнов-боксом прокариот) или просто «ТАТА»-последовательностью, показан на рис. 16.1. Наличие такой последовательности характерно для транскрипционных единиц, в считывании которых участвует РНК-полимераза П. Изучали способность клонированных генов, включающих 5'-фланкирующие последовательности, направлять транскрипцию (п ей!го и (п 7(то с использованием тест-систем, позволяющих оценивать точность инициации транскрипции в 5'-концевой области клонированных последовательностей.
Таким образом, при работе с клонированными мутантными и нормальными ДНК удается провести сравнение, позволяющее установить, какие из остатков 5'-фланкирующей последовательности действительно необходимы для нормального функционирования промотора. Эти исследования показали, что ТАТА-последовательность необходима для правильного выбора цепи ДНК и точки инициации транскрипции. Эта регуляторная последовательность наряду с другими участками последовательности контролирует также эффективность инициации транскрипции. Для осуществления точной транскрипции зп уйто недостаточно присутствия только очищенной РНК-полимеразы П и клонированной последовательности ДНК. Необходимо также присутствие неидентифицированных в настоящее время белков.
Была разработана кроме того удобная система транскрипции ш чтчо, основанная на инъекции клонированной ДНК в очень крупные ядра ооцитов африканской шпорцевой лягушки Хеяортьт. Инъецированная ДНК связывается с гистонами Мутзгенез ш Нпо с ввелением винкерных всгюшк ДНК нормального гена М Рзгулящрная область Кодирующая область 5' 5' Стадия т Нуклеа»а 3) Экзонуклеаза !и удаляет нуклеотищг с 3'конов — ) Эк»оиуклеа»а Ш Нуклеюэ Я атакует одноцепочечную ДНК Набор 3'концевых фрагментов, содеркащнх проксимэльнмс участки ретуляторной области Набор Зсконцевых фрагментов, содеркащих днстельнме у ватки регула торной области Кодирующая ошгащь 3 Стима 3 Стадия 4 Регуляторная область Кодирующая область и образует нуклеосому, имитирующую естественный субстрат для транскрипции в ядре.
Хорошим примером применения такого подхода является мутацнонное картирование регуляторных последовательностей, необходимых для транскрипции гена тимидннкиназы (г(с) вируса герпеса. Этот ген может Рис. 16.2. Мутагенез кч уйто используется для выявления 5ьфлаикирующнх последовательностей, участвующих в контроле транскрипдии. На стадии ! рестрикциоииый фрагмент ДНК, содержащий ген й, подвергают расщеплению с обоих концов экзоиуклеазой 1П и нуклеазой Б1. Образующиеся продукты расщепления для большей наглядности изображены здесь в виде двух наборов дискретных 5с н йикоицевых фрагментов. В действительности, индивидуальные фрагменты как таковые идентифицируют только после клонирования и определения нуклеотидиой последонательности, как показано на схеме (стадии 2 и 3).
На стадии 2 к концам каждого нз фрагментов в смеси присоединяют Ваш Н1- линкеры и проводят встраивание в вектор рВК322 по Ваш Н!-сайту. После этого индивидуальные фрагменты могут быть получены с помощью клонирования рекомбинантных плазмид в Е. сей, как обсуждалось в гл. 9 (стапия 3). Экспрессия генетического материала К кошюм фрагментов казщог а набора прясоединяют линк ер, содерлюшии Ю п.н. )в ленном случае Вощ Н). пинкер) и включмошвн сзйт рестриквии, отсутствующий в ДНК гена И никога типа Все фрагменты расщепляют рестрнкта»ой йощ Н) дпя создании липких конц»в и клонирования в векторе РВК 322 ла ВащН)-свату Клонирование пазвшыет выделить индивндузльные фрагменты в чистом виде н идентифицировать их с помощью овределення «уклеотидной последовательности Рекомбинапией ~п чцго иинивидузланых фрапчетгю н» 3 .конпевого и З.концющго наборов по Ващ Н).сайту мшкно получить пслмй ряд разин«ных мутантных генов гд стлтсссссл тссссссаг аслтсстст п тслпссс сллпсг ллс ласлслтсс лстссссссс сссссг тссс лсстсслстт ссслтлпл* сстслсссастсссстссл лслссслссслссстсслсс ь -2ю Он стлтсмслс ссслтссис ссслистгт тстслттссс сллпссллс лссслслтсс лстсссссгс ссссз стссс лил ослеп ссслт лпл* сстслсссст сгссссксл лслссслссс лссасслсс ь -22 о-ю стлтглтвлс лслллссссл тсссссстст тстслттссс с*лпссллс лгсслслтсс лстсссисс сг сссстссс лс2тсслсгг ссслтлттлл сстслсссст стсссстссл лс*ссслссс лссстсглсс 25 -2052 и стлгслтслс лглллссссс ссслсссссл тссссттссс смттссллс лссслслтсс лстссссссз.
Оссссстссс лсстсслсп < сслтлплл сстслгссстстсссстссл лслссслссс лссстсслсс ь -Озз-вз стлтслюлс лслллссссс ссслссстст тстслтсссс лтсссссллс лссслслтсс лстссссссс сссссстссс лог тсслстт ссслтлттлл сстслсссст стсссстссл лслсгслссс лссстсслсс ь 2мз и алтслтслс лслллссссс ссглз.сстст тсклттссг асслтсссс лссслслта лотоса,ссс асссстссс лсстсслат ссс*тлплл ссгслсссст стссссксл лслссслссс лссстсслсс ь -022-20 стлтзлтслс лслллгсссс ссслссстст клслпссс сссилтссс сссглслтсс лстгг сг ссс сссссстссс лсстсг лотт ссслтлплл сстслсссст стсссстссл лслссслси лссасслсс с стлтслтслс лслллссссс ссслссстст тстслпссс сллттссмс сссслтсссс лот ссссссс сссссстссс лсстсслсп ссслтлплл сстслсссстстсссгтссл лслссслссслссстсслсс 25 -20 -00 25 0езло стлтслтслс лслллсгссс гсслссстсг тстслпссс сллттссллг лссслслтсс лсссслтссс ссссссгссс лсстсслстг ссслтлплл сстслсссст стсссстссл лслссслссс лссасслсс ь -202-00 сглтслтслс лсмлссссг ссслв.сстст тстслпссс сллпссллс лссслслтсс лстссаолт сссссстссс лсстсслсп ссслтлплл сстслсссстстг.ссстссл лслссслссс лссстсслсс ь -з -0 сглтслтслс лслллссссс ссслссстст тстслттссс смпссллс лссслслтсс лстгсссссс ссосссслк ссстсслстт салтлплл сстслсссст стсссстгсл лслссслссс лсгстсслсс ь -ю-зт стлтслтслс лглллгасс ссслссстст тстслпссс сллтксллс лссслслтсс лстссссссс сссссстссе сслтссссп ссслтлттлл сстслгссст скссстссл лслссслссс лссстсслсс ь -Оз.-зз лслллссссс ссслссстгт тстслпссг сллпссллс лссслслтсс лстссссссс сссссстссс лсстсслстт ссссслтсс сстслсссст стсссстссл лслссслссс лссстсслсс с лслллссссс ссс*ссист тстслпис сллпссллс лссслслтсс лг,тссссссс сссгсстссс лсскслгп ссслтлплс сслтссссстстсссстгсл лслссслссс лссстсглсс Ь -202-И 25 -222-О стлтслтслс стлтслтслс отлклтслс лслллссссо ссслссстст ъпслттссс сллпссллс лссслслтсс лстссссссс сссссстссс лссп глстт ссслтлтглл итссссса сссссстссл лслссслссс лссстсслсс ь - о -0 стлгслтслс лсмлгсссс ссслссста тстслттссс сллпссллс лссслслтсс лстссссссс сссссстссс лсстсслстт ссслтлплл сстслсссстсгссссслтс сссссслссслссстсслсс ь -22+в стлтслтслс лсмлссссс ссслссстст тстслпссс сллпссллг лссглслтсс лстссссссс сссссстссс лсскслсп ссслтлплл итслсссстстсссгтал лглсгсссслксис*сс 25 +22 о рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
