Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Характерно, что 5'-концевая последовательность мяРНК Ы комплементарна обобщенным 5ь и 3'-концевым последовательностям интронов. Это означает, что за счет комплементарного связывания соответствующих участков интронов и мяРНК Ы может достигаться сближение концевых последовательностей данного интрона, обеспечивающее нх взаимную ориентацию, необходимую для правильного сплайсинга (рис. 16.10,А). Более того, оказалось, что мяРНК ()2 содержит участок, комплементарный концевым последовательностям некоторых экзонов, соединение которых в ряде мРНК происходит после удаления соответствующих интронов (рис.
16.10, Б). Это свидетельствует о том, что мяРНП представляет собой по крайней мере часть молекулярно~о аппарата сплайсинга. Кальантомн-, навый ген 5'— -Накопи Руащщай актом А акодн Румына кзон кодд румщай "алащоо СОВР зкзон О щщуССР ко нруамщщ зкпзн С тяРНК. транскрнпт ната- СОВР Сым3ы3 палладе. ннлмрованна Пронссаннт РНК тлролдныс 1'нпатэламус клсткн — 3 5С ЗР™ая мРНК 5' ! трансллпмл мРНК ° ) Оещнй кадщн т учааток е 6 щщщ Сс СООН ХН,-~цш к е 4 ~Ю~~~4 СООН Псрвнчный продукт трансллцнн Белок 17,4кД ! Бснзк 15.9 кд црпсоллтлчсскмй працсссннг ) Зрелые паллпсптнлм СОВР 37 амннакнслотных аснмкоэ Кальшпоннн 32 амлно«нслотнь остатка л ССР СООН -43ССССССум е С зканцсвой пснтапсптлц ех концавай псптнд(83 амннакнслатных ктатка) ен-коняевой псптнд (81аммнокнсло ный остаток) Рис. 16.9.
Модель альтернативного сплайсинга гяРНК, обеспечивающего продукцию кальцитонина и кальцитониноподобного пептида (СОВР) в тнроидных клетках и клетках гипоталамуса соответс~венно, (По Ащага 5. б, е! а1, !982, Ха!пге, 298, 240.) А К.К онац гнРНК зчКонад гяРНК А-С-С х С-А-О С-13-А-А чэснч С-0-С-С-А-Щ Интрон— 146 126 О 2-РНК 3' — С-С43-О-С-С-13-С.С-!3-13-С.С А-О-С-А43-А-А-С вЂ” 5' и!|! ° ма!а!щ гЯРНК 5' — С С-С-С-0-СЛЬО-С-А43 С-С-0-С-СЩ-С-С 0-0 — 3' ГНРНК Рис. 16.!О. Возможные варианты участия мяРНК (3! и 132 в удалении интронов из гяРНК. А. Молекула (31 образует систему водородных связей с 5С и Зчконцевыми участками интро- нв„сближая концы соседних зкзонов.
(По 2егпег М. К, е! ц1а 1980. На!иге, 283, 220) Б. Молекула 1.12 образует водородные связи с 5С н Зцконцами соседних зкзонов, что сопрово- ждается «выпетливаниемн соответствующего ннтрона, способствующим его удалению. (По 0)тз(т!щл У еу п1т 1980. Ргос. Хаг. Асад. 8с!. СВА 78, 4471.) 22О Экспрессия генетического материала Транскрипция и структура хроматина Гигантские молекулы ДНК в ядрах зукариотических клеток чрезвычайно плотно упакованы в хроматиновую структуру, которая представляет собой иерархическую систему сверхспирализации нуклеосомно-связанной ДНК.
Образование спиралей высших порядков, которые описывались в гл. 4,несомненно, делают ДНК недоступной для действия транскрипционного аппарата клетки. Процесс транскрипции связан с определенными изменениями в структуре хроматииа. Клонированные фрагменты ядерной ДНК могут быть использованы в качестве радиоактивных зондов для изучения изменений в структуре хроматина, которыми сопровождается транскрипция соответствующих ~снов.
Об изменениях в структуре хроматина в области интенсивно транскрибируемых последовательностей свидетельствует их повышенная чувствительность к расщеплению ДНКазой 1. О способах обнаружения такого рода структурных изменений подробнее рассказзявается в Дополнении 16.1. Считают, что повышение чувствительности к ДНКазе 1 в области активных генов связано с образованием открытых участков хроматина Даже на таких открытых участках ядерная ДНК остается все же более устойчивой к действию ДНКазы, чем свободная ДНК, вероятно, за счет сохранения связи с нуклеосомами. Размер открытых участков хроматина, которые в большей степени, чем компактные участки, доступны действию ДНКазы„может достигать нескольких тысяч нуклеотидных пар.
Это означает, что так называемые хроматиновые домены по размеру значительно превышают обычные транскрипциоиные единицы. Экспериментальные приемы, описанные в Дополнении 16.1, были использованы также для изучения структуры хроматина внутри активных доменов. При обработке ядер даже небольшими количествами ДНКазы 1 в структуре открытых участков удается выявить наличие гиперчувствительных областей. С помощью радиоактивных зондов, полученных на основе очень небольших рестрикционных фрагментов из различных участков определенного гена, удалось установить, что гиперчувствительные области располагаются в 5'-фланкирующей последовательности ДНК активной траискрипционной единицы.
Так, гиперчувствительный участок, прилегающий к гену Ж вируса герпеса„локализуется в области от — 4 до — 182 п. н. (см. рис. 16.4), включая как ТАТА-последовательность, так и дистальные последовательности, необходимые для инициации транскрипции. Было установлено, что наличие гиперчувствнтельных к ДНКазе участков в 5'-концевой области транскрипционной единицы является характерной особенностью активно транскрнбируемых генов. По крайней мере в некоторых случаях зти участки оказываются также чувст.вительными к действию эндонуклеазы Я1, расщепляющей одноцепочечную ДНК, что указывает на возможность возникновения в гиперчувствительной области неканонических структур ДНК.
16. Регуляция экспрессии генов у эукприот 221 ЛЩЙМЙФИЙФМ~В3 йОЦДй!ЙЩ$ЯФФНЩЬйЩф%3~фЦтй ! з кйзлг:; -, Структуру участков хроматина, содержащих гены, клонированные в составе рекомбинантных векторных ДНК, можно изучать непосредственно на интактных ядерных ДНК, в качестве критерия используя различия в чувствительности к действию иуклеаз. Участки ДНК, входящие в область «открытых» хроматиновых структур, более доступны нуклеазной атаке, чем участки, существующие в виде более компактных структурных образований. Разрушение клеток в гомагенизаторе тканей Ввглсщпне ядер центрифугировапием 0,2 0,4 0,6 777 3. Раащепление ДНКазой ! (мкг1мл) 4. Выделение ДНК и расщепление рестриктазой а Анализ набора фрагментов ДНК с помощью злектрафареза в геле, переноса ло Саузерну и гибридизации с радиоактивнымп зондами 1 и 2 Зонд ! Зонд 2 г.' о 6, Радиоавтографив — + 0,2 0,4 0,6 0 0,2 0,4 0,6 ДНКаза ! (мкг/мл) Рис.
16.1!. Обнаружение участков хроматиновой ДНК, чувствительных к расщеплению ДНКазай 1. Рестрикционный фрагмент, выявляемый по гибридизации с зондом 1, устойчив к ДНКазе 1, вероятно, ввиду защитного действия структуры соответствующего участка хроматнна. Напротив, другой рестрикпионный фрагмент, гнбридизующийся с зондом 2, чувствителен к действию ДНКазы 1.
С увеличением концентрации фермента в рещгционной смеси колпчестно соответствующего фрагмента убывает. Для обнаружения таких участков ДНК проводят мягкое разрушение клеток, не сопровождающееся разрушением ялер. Аликвоты ядерной фракции подвергают действию возрастающей дозы иуклеазы типа ДНКазы 1, которая вносит одноцепочечные разрывы в двухцепочечную ДНК. После этого из каждой аликвоты вьщеляют ДНК и подвергают ее расщеплению определенной рестриктазой. Полученные препараты анализируют с помощью электрофореза и гибридизации по Саузерну 222 Таким образом, рассмотренные выше подходы надежно свидетельствуют о существовании в хроматине гиперчувствительных областей ДНК.
Они позволяют также выявить корреляцию между транскрипцией и возникновением гиперчувствительных участков вблизи точки инициации транскрипции. В то же время следует помнить, что обнаружение корреляции еще не означает установления точной причинно-следственной связи событий. Лишь в некоторых случаях с помощью генетического анализа удалось показать, что последовательности гиперчувствительных участков ДНК действительно необходимы для инициации транскрипции. Наиболее интересен пример транскрипции гена 5дз4 1згозор)з!!а, о котором упоминалось в гл.
9. В 5'-фланкирующей и структурной областях этого гена было выявлено пять гиперчувствительных участков (рис. 16.12). Эти участки обнаруживаются только в ДНК, выделенной из ядер клеток слюнной железы в стадии развития, сопровождающейся активной экспрессией гена 5дз4. Известны мутанты, которым не свойственна экспрессия этого гена.
Соответствующие мутации картируются в 5'-фланкирующей области гена. У двух типов мутантов делегированы наиболее удаленные гиперчувствительные участки ДНК (рис. 16.! 2). В случае наиболее отдаленной делеции (Вег) налицо практически полное отсутствие транскрипции гена 5дз 4. В хроматине клеток слюнной железы у мутантов Вег обычными методами в районе гена -580 — 505 — ЗЗΠ— 70 эзо ягяюж окг чзщяизяпи ВЕК Рис.
16.12 Участки, гиперчувстви- тельиые к ДНКазе 1 в области 5сковпа гена 5954 и в предшествую- щей области ДНК из ядер клеток слюнной железы Зэюзор)з!)0. Размеры серых кружков отражают относи- тельную чувствительность соответ- ствующих участков к ДНКазе 1.
Фи- гуриой скобкой отмечен весьма про- тяженный гиперчувствительный уча- сток в области — 330. Внизу отмечены две делеции, упомянутые в тексте, (По 877егпзоеп А. В'„Весйепдо~У 5. К., !982. Се!1, 29, 601. Сорупдщ 1982 М. 1.Т.) (см. гл. 9). В качестве зонда для локализации искомых рестрикционных фрагментов после электрофореза используют клонированные радиоактивно меченные фрагменты соответствующих генов. Обработка ДНКазой 1 не приводит к изменению положения рестрикционного фрагмента ДНК на электрофореграмме, поскольку точки расщепления ДНКазой 1 случайным образом распределены по обеим цепям ДНК.
Если участок ДНК оказывается доступен действию ДНКазы 1 (как в случае участка, комплементарного зонду 2, рис, !6.!!), то при увеличении Экспрессия гепепзичгского мап7ериала концентрации ДНКазы количество фрагмента в пробе и интенсивность сипзала иа ралиоавтограмме падают. Такое поведение характерно для транскрипционно активных областей ДНК, Участок ДНК, фрагмент которого гибридизуется с зондом 1, ведет себя в данных экспериментах аналогично участкам, расположенным в неактивной области ядерной ДНК; количество фрагмента с увеличением концентрации ДНКазы 1 практически не меняется, поскольку соответствующий участок недоступен действию фермента 16. Регуляция экспрессии генов у эукариот 223 бдэ 4 не удается обнаружить гиперчувствительные участки, выявляемые в норме, в том числе и те, которые локализуются вне области делеции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
