Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (522944), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Аз а Пепега! ы1е (ог ргосе!пз спаса)п!пВ а СВТ саП, С А,„„= 0.5 шиш!. ТЬе у!е18 ос ргосегп спау а1ю Ье з)есепп(пе8 Ьу зсапс)агс( сЬгопюВеп!с псесЬЯог)з (е.В., Еомту ог Вгайог8). 1Е сЬе сочту спесЬос) ь ыей сЬе зашр1е пшзс 6гзс Ье йа!ухе8 аПа)пзс 2000 чо!ишез оГ сх РВ5 со гепюче сЬе В!шасЬюпе, юЬссЬ сап !псегуеге зч(сЬ ргосеш гпеазшепзегсс. ТЬе Вгайоп1 шесЬос( сап Ье регуоппес( ш сЬе ргезепсе оу 81исасЬюпе. РКОТЕОЕсТ!С СЕЕАсуАСЕ ОЕ ТНЕ ТАКСЕТ РВОТЕ)Ь( ЕКОМ ТНЕ ВОЕ)Ь)!3 СВЕ МО)ЕТУ а.
АсЫ йгошЪсп, епсего)с)пахе ог Рассог Ха (аз арргорпасе 1ог сЬе с1еачаВе ясе сч)сЬш йе Еиз!оп ргосесп) со йе ЬеасЫ)зе 50 ипЬз оу сЬе арргорпасе ргосеазе ш 1 гп1 оу РВ5 Еог еасЬ ии1Ииег оу геяп чо!ипсе. Мсх сЬе зо1исгоп Ьу спчегПпВ йе сиЪе зечега) сииез, аис1 спсиЬасе сЬе пихсиге сч)сЬ зЬаЫпВ (ог 2 — 16 Ьоигз ас гоош сепсрегасиге. ТЬе ехасс сиие зЬои1с( Ъе с)есегш!пес( ешр)гкаПу ияпц япаП-зса1е геасПопз.
Ь. Сепсг)уиВе йе шЬе ас 500е (2100 грси ш а 5огчаП 55-34 го!ос) 1ог 5 пипи!ее ас 4'С. СагебиПу сгапзуег сЬе ясрегпасапс со а ЕгезЬ шЬе. ТЬе СВТ зЬои!Й зиП Ье Ьоипс( со (Ье псаспх апд сЬе ргосеш оу гпсегезс зЬои!г) Ье !п йе зирегпасапс. ТЬе сЬгогпЬсп ог с!зе Еассог Ха итП а1ю Ье !и сЬе зирегпасапс. ТЬе ргосеш о( шсегезс сап Ье зерагасес) Вогп йе ргосеазе Ьу сопчеп6опа! сЬгошасоВгарЬу ог Ьу 5Е15-ро!уасгу!ашгВе Ве! е1ессгор1югезь.
15. Апа1ухе сЬе ргосе!п рго61е оу еасЬ яер (сеП ехсгасс, ччазЬез, апс( е!иПоп) оп а !Оей 5Р5- ро1уасгу! ашЫе Пе1. ТВОЕ)ВЕЕ5НООТ!ЫСс 1ЫВОШВЕЕ РВОТЕ! Ы5 !пзо!иЫе С5Т Ьсз)оп ргосе!пз (с)есессес) Ьу сЬе ргезепсе о( (из)оп ргосе!и !и йе ргеПш)пасу !пс)исПоп ехр 'ппеп(з апс1 Ьу йе аЬзепсе о( СЬе ро!урерс!с)е айег аППп(су сЬгошасоПгарЬу, ог !и сеП (гасПопасюп ехре гпепсз) сап аЬо Ье зо)иЬП!хес1 чч!(Ь йе (оПоъмпц де(егВепся 1 А (ч(ч) Тпсоп Х-100, 1 А (чМ Тччееп-20 р 10 шм йсЬ!осЬге!со), 0.03% (ччМ 5(35, апг( езрес(аПу 1.5;4 (ччгч) А(-!аигоу!загсоз!пе (5ш!(Ь апс) )оЬпз 1988; ГгапПе! ег а!. 1991; Спесо е( а!.
1992). 1. ЕоПоъч йе гпйп ргососо! (ЬгоиВЬ 5сер 7. 2. Сепсг!(06е йе сеП (узасе ас 10,000е (7300 грпс !и а 5огчаП 55-34 госог) (ог 10 гп)пи!ее ас 4'С, гешоче а заче йе зирегпа(апс, апс! гезизрепд реПес !и 8 гп! о(1.54 А(-!аигоу!загсоз!пе, 25 шм сг!есЬапо!ат!пе гпм ЕОТА (рН 8.0). 3. М!х йе зо106оп 1ог 10 папи!ее аС 4'С апс) йеп сеп(г!(ице аз !и Еаер 2 аЬоче. 4. СошЬ!пе ясрегпасапсз (гоги йе !и!с!а! с)есегВепс-(гее сеП 1узасе апс) йе гезо1иЬПгеед сеП реПес. 5.
Ргосее8 чч!СЬ йе гегпа!пс)ег о( СЬе рго(осо! Пгогп Еаер 9). Рго1осо! 6 Риггйсабоп о1 Майоье-Ь~псйпц Галоп Рго1е~пь Ьу Ай~пйу Спгогпа1одгарйу оп Агпу!оье Кеып лион-в!Есн!с~с Рвотны !МВР) гссяосчв сгмвлтг вгсомв!гслят Рвотнгсв сп а Еогш сЬас сап Ье рипбед Со пеаг Ьопсо8епеду Ьу аубпду сЬгогпаго8гарЬу !Непп!8 апд 8сЬаЕег 1998). МВР, а репр!аапис ргосе!и епсодед Ъу йе та!Е Пепе оЕ Е. со)1, !а а сошропепс оЕ йе ша1соъе сгапарогс ьуасеш оЕ сЬе Ьассепшп. МВР Ьаа ап ай)п!су сп сЬе ппсгопю1аг гап8е Еог пса!сохе апд ша1содехсппа апд сап сЬиа Ье рип6ед оп гпасгкеь сопяьдп8 оЕ аи8ага сгоя-Пп)сед со ап а8агоье гпасПх.
ТЬе та!Е Пепе ргодисс со!егасеа а ъч!де чапесу оЕ Еияопь апд !х сЬеге!оге а ихеуи1 расЬ Ьогье сп ехргеьяоп хсиеПеа (ЯсЬасг апд Вес)сьч!ЕЬ 1990). ТЬе РМА1.-с2 ог РМА1.-Р2 чесСогь !д! Сиап ес а!. 1988; Ма!па ес а1. 1988; Ыеъч Еп81апд В!о!аЬь) сои!а!и сЬе !РТА-!пдис!Ые гас ргошосег ад)асепс со ап ехсепяче ро1ус1оп!п8 ясе апс1 ап гжВ сегпппасог. ТЬе ро1уПп1ъег храпя сЬе апппо сегш!пиа оЕ йе а-еогпр1епсепсадоп Ега8- шепс оЕ !3-8а1ассоядаае, аПоъч!п8 Ыие/ъчЬ!се скгееп!п8 оЕ ЬассеПа! со!оп!еа ъчЬеп с!оп!п8 !псо сЬеье чессогя Весаиае сЬе р!аяп!да а1ьо сопса!и йе гуч аПе!е оЕ сЬе !ас! 8епе, ехргеъяоп оЕ МВР Еиыоп ргосе!па сап Ье шдисес1 Ъу!РТС !п спой асса!пь оЕ Е.
со16 А ьрасег вес)иепсе оЕ сеп азрага8!пе геядиеь аерагас!п8 сЬе тгс!Е вес)иепсе Егош йе ро!ус!оп!п8 ясе Еасдпасеь е1еача8е оЕ сЬе Еияоп ргосе!и Ьу Рассог Х ргосеаае апд, !п адд!с!оп, шау епЬапсе йе аЪ|16у оЕ йе МВР Еияоп ргоСеш Со Ьспг) Со сЬе аЕ6ппу геяп. ТЬе Раегог Х ргоСеаае с1еачаце яСе !11е-С'1и-С1у-Аг8) Пег пгппееПасе1у ад)асепс со сЬе Есгас геасПесюп епхупсе ясе !Есор!) ш сЬе ро1ус1оп!п8 ясе. ТЬе Рассог Х ргосеахе с!еача8е ясе псау Ье гер1асед аь деягед Ьу а хеъ)иепсе епсод!п8 а с1еача8е ясе Еог осЬег ргосеааея якЬ аа сЬгошЬсп ог епсегоЫпаае. РМА1-е2!ас)ьь сЬе МВР я8па! ьеъ)иепсе, ъчЬегеах РМА1.-Р2 сопса!па сЬе МВР я8па! ьеъ)иепсе сЬас еПгесь МВР Еияоп ргосе!па со йе реПР1аяпк арасе.
Ехрогс спсо сЬ!ь сошрагсшепс аПоъчх гарсд !ао1ас!оп Ъу ояподс ьЬос)ъ, десгеааех ехроаиге оЕ сЬе Еияоп ргосеш со ргосеаяея апд сп гипсе еааея аПоъча йе Еоппадоп оЕ д!ьи1Егде Ьопдв ш йе Еоге!8п ргосе!и. )ъ)ос аП йаюп ргосе!пя Ьоъчечег, аге ехрогсеъ1 ейксепс1у !псо йе репр!аяп. ТЬия апу адчапса8е оЕ саг8едп8 со сЬе репр1аяпк арасе шифс Ье еяаЫсхЬеъ1 ешр!ПсаПу. МВР Еияопх Ьаче а росеп6а1 адчапсаце очег СВТ Еияопя йе та1Е Пепе ьеъ!иепсе св депчед сгогп Е. гпП апд ьЬои1д сЬегеЕоге сопСаш сЬе аРРгоРпасе содопв апд е1ешепга оЕ пЖъь!А ьесопдагу ьсгиссиге сЬас аге геъ)и!гед Еог еЕ6с!епс ехргеах!оп !п йе Ъассепшп.
Ву сопсгаас, йе ейесс)чепеха сп Е. сой оЕ йе апа1о8оиа СВТ ьегсиепсе, ъчЬкЬ !а депчед Ьогп а рагаядс ог8апып, !а ип)ъпоъчп. Ноъчечег, по сПгесс согпрагсхопь Ьаче Ъееп риЫ!аЬед оЕ сЬе еЕЕсс!епеу ъч!сЬ ъчЬссЬ йе съчо суреь оЕ чессогз ехргеах а аепеь оЕ Еияоп ргосе!пя 15.40 Ргокого! бг Риг!)сепг(оп оГМВР РисИоп Ргосе(пь Ьу А11(тсу СЬготасо5гаРЬу оп Ату(оье Яеьт 15А1 МАТЕЙ!АЕЬ САОТ1ОЫс Р!еаье ьее Аррепс)!х 12 Еог арргорпа!е Ьапс)1!пд оЕ пса!ег!а1ь таг)сег) чча!Ь <! >. ВНГГег5 апд Бо!06оп5 Р!еаье ьее Аррепк))х 1 Еог сопсропеп!ь о( ь1осЬ ьо1и!!опь, Ьп((егь, апс) геааепсь. О!1п!е ь1осЬ ьо1иоопь !о !Ье арргорпа!е сопсеп1гапопь.
Сед ГусИь ЬиПег ( — 750 тИ ЗО гпм Тга-С1 (РН 7.1) 0.1 гпм ЕЕ)ТА 2096 (и)ч) ьиегоье СеИ счаьЬ ЬиПег ( — 250 тИ !О тм Тпь-С) (РН 7.1) ЗО псм НаС! Со1ито е1иИол ЬиПег (-700 т1) 10 гиМ Тпь-С) (РН 7.5) !0 гпм таЬохе Со(итп ччаьЬ ЬиПег Г-250 тИ 10 тМ Тга-С! (РН 7.1) ! и НаС! МВС1, ГО. 7 гпМ, — 250 тИ РМ5Г (700 тМ) <1> Ас)с) 17.4 ги8 оЕ РМ5Р рек пи11с!аек оГ Ьоргорапо1. 5соге ас — 20'С. РМ5Р Ь )ссаес!касас) !и ас)иеоиь гю!каюпь. ТЬе гасе оЕ !паепчапоп !псгеаьеа сч)сЬ !псгеаь!08 РН апс) о Еаьсег ас 25'С сЬап ас 4'С.
ТЬе Ьа!Е-Ие оЕ а 20 гпм аоиеоиь зо1исюп оГ РМ5Р Ь -З5 пипи!ее ас РН 8,0 Наспех !978). ТЬЬ ьЬогс Ьа1(-!!Ее псеапх йас ас)иеоиь ьо1сп1опь о( РМВР сап Ье ьаЕе!у 8!ьеакс)ес) а(сек йеу Ьаче Ьееп геидегес) а1)са1!пе (РН >8.6) апс) поке8 Гог ьечега1 Ьоигх ас гоого сегпрегасиге. Ап а!секпас!че со РМ5Р (4-(2-агпспоесЬу!)-Ъепгепеьи1(оиу1йиогсс(е, ЛудгоеЫоггае; РеГаЫос 5С) а ачас1аЫе Егот ВоеЬпп8ег МаппЬеип. Ре(аЫос Ь ап сггечегь!Ые ьеопе ргосеаье спЬсЬссог, !ь пьес) ас йе хасае сопеепсгасюп аь РМ5Р, Ьис Ь попсохсе апа ьсаЫе |п ас)иеоиь ЬиКек ьо!ииопь.
7х 5Р5 Ве(-1оаеопц ЬиПег 5соге 1х 5Т75 8е1-1оайп8 Ьипег )ае)с!п8 ййюс1сгеио! ас гоопс секпрекасспе. АсЫ йсЬюсЬге!со! Егокп а 1 м пое1с, )иьс ЬеЕоге йе Ьипег Ь пьес). Тг(ь-С1 (70 тМ, РН 7. 7) Епгугпе5 апд Войегь ГЗА)аье Г5 гпту/гпИ Гуьохуте )с)ч)аье (5 тВ)т1) ТЬготЬт, Гп(егохгпаье, ог Гас(ог Ха ьо!иИоп Ро!!осч сЬе гпапиЕаесигег'ь гпьскиесюпх Еог сЬе ргерагапоп апс) ьсога8е о( йеье ркосеаьеь. СЕ!5 Ро)уасгу1ат(кГе Ве1 (707 ) сопса101пе 5О5 <1> Рог ргерагапоп оЕ 5Г75-ро)уаску!асп)с)е 8е!ь пьес) !и сЬе ьерагасюп о( ргосеспь, р!еаье ьее Аррепйх 8.
Сеп(г!Годе5 апгь КоГог5 Вес)ктап 7160 го(ог ог ек)и1ча)еп! 5огчаИ С54 гогог ог ес)и(ча)епс 5огчаИ 55-34 госог ог ес)и(ча)епс Ргососо! 6| РигугсаВоп оЕМВР Рит|ои Ргогетт Ьу Афи|0г СЬготаточгарсгу ои Ату1оте Яетт 15 43 с. 5ргеа|1 сЬе сеП реПес агоцпс3 йе зЫех оЕйе сепсп6лВе сцЪе. А|Ы |се-со!а 0.1 гпм МВС1, |ю1иПоп (100 гп1ЛЬег опВ!па1 сц|шге чо1шпе) апс( хйг сЬе яьрепяоп Еог 10 ш|пцсех ас 4оС д. СепспЕцВе йе хЬос)сег) сеПх ас 17,200г (12,000 грп| тп а 5отчаП 55-34 гогот) Еог 10 пппцсех ас 4"С.
А|Ы 1О шм ТпмС! (РН 7.1) цп61 йе РН оЕ йе ялрегпасапс ь 7.1. е. Й!сег тЬе ялрегпасапс сЬгоцВЬ а 100-ш1 с(|хрокаЫе сха)Пепе 61сег (0.45-рсп п|стосеПц1охе п|етпЬгапе), апс! гПа1уке йе Ес!сегес) хо!цсюп аВашас 100 чо!цшех 10 гпм ТпмС1 (РН 7.1) ас 4"С. Ргосеегс со риису |Ье Еияои ргосе|и Ооги |Ье тиреггтасаис Ьу агиусоге-айагохе сЬгогиасор аРЬу аг гсехп(Ьегс |и 5сер 4.
4. Рош йе ялрегпатапс сгош 5сер 3 очег йе со1шпп. К!пхе тЬе со1ишп чч|сЬ 100 ш1 оЕ 10 шм ТпмС| (РН 7.1). Рам 100 тп! о( со1шпп счахЬ Ъцйег сЬгоииЬ сЬе со|циси. 5. В1цсе |Ье Ъоцп|1 Ецяоп ргосеш чч(сЬ 50 п|1 оЕ со1шпп е1цПоп ЬцЕЕег ап|1 соПесс 1-ш! Ьасс|опя 6. Апа1уке аПгсцосх оЕ йе соПессес( Пассюпх Ьу 5О5-ро!уасгу!аспЫе Ве! е!ессторЬогеях со с)есептппе сЬе !осаПоп оЕ |Ье 6ы|оп ргосеш ш йе хепеа оЕ е1цбоп Егассюпя Роо1 йе ЕгасПопх сопса!п|пВ сЬе 6ляоп ргосе|п, апс! хсоге йесп ас -70'С. 7. СЛе сЬе арргорпасе ргосеахе со с|еаче йе Пляоп ргосеш Егош йе МВР пю|есу.
а. А|Ы сЬгоп|Ъ|п, епсегоЫпаае ог Рассог Ха (ах арргорпасе Еог йе с1еачайе ясе сч(сЫп йе 6ляоп ргосе!п) со сЬе Ъеаг)х. 3Ле 50 цп|сх оЕ йе арргорпасе ргосеахе ш 1 п|1 оЕ РВ5 Еог еасЬ пц!1 ПЬег оЕ геяп чо1шпе. М(х сЬе сю1шюп Ьу (пнегПпВ йе сиЬе хечета) Птпея апс( |псцЬасе сЬе пцхшге сч(сЬ хЬаЫпВ Еот 2 — 16 Ьоцгх ас гоош сешрегасцге. ТЬе 0|ие гегсшгегс со оЬсаш гиахш|иши у|еЫ оЕ |Ье Тоге(йи ргосе|и |ЬоиЫ Ье гсесег|и(иегс егир|г|сайу ияий явасс-всасе геассюих.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
